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Apr 29, 2023

Una pantalla de diseño de experimentos revela que Clostridium novyi

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 118 (2023) Citar este artículo

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Aunque Clostridium novyi-NT es un agente terapéutico bacteriano anticancerígeno que germina dentro de los tumores hipóxicos para destruir las células cancerosas, todavía se desconocen los desencadenantes reales de la germinación de C. novyi-NT. En este estudio, seleccionamos germinantes candidatos mediante diseños experimentales combinatorios y descubrimos por casualidad que la D-valina es un germinante potente que induce una germinación de esporas del 50 % a una concentración de 4,2 mM. Investigaciones posteriores revelaron que cinco análogos de D-valina también son germinantes y cuatro de estos análogos son pares enantioméricos. Este efecto estereoflexible de L- y D-aminoácidos muestra que la germinación de esporas es un proceso complejo donde las interacciones enantioméricas pueden ser factores de confusión. Este estudio también identifica la L-cisteína como germinante y la hipoxantina y la inosina como cogerminantes. Varios otros aminoácidos promueven (L-valina, L-histidina, L-treonina y L-alanina) o inhiben (L-arginina, L-glicina, L-lisina, L-triptófano) la germinación de una manera dependiente de la interacción. La D-alanina inhibe toda la germinación, incluso en medios de crecimiento complejos. Este trabajo sienta las bases para mejorar la eficacia de la germinación de las esporas de C. novyi-NT en tumores.

Clostridium novyi Tipo A es una bacteria anaerobia obligada formadora de esporas que causa mionecrosis clostridial, cabeza grande y hepatitis necrótica en ovejas, cabras y cerdos1. En particular, es responsable de la cabeza hinchada 'Dikkop' en el carnero, una infección que ocurre a través de heridas infligidas entre carneros jóvenes cuando pelean, y la muerte ocurre dentro de las 48 a 72 h2. C. novyi es más un patógeno en el ganado que en los humanos, con la excepción de un brote esporádico de infecciones entre consumidores de drogas en Escocia cuya heroína había sido contaminada con esporas de C. novyi3.

C. novyi-NT, una versión no letal de la bacteria de tipo salvaje generada a través de la atenuación de su toxina alfa, se encuentra actualmente en pruebas clínicas como terapia experimental para tumores sólidos4,5. El potencial terapéutico de C. novyi-NT deriva de su capacidad para colonizar selectivamente las regiones hipóxicas (<0,5% de oxígeno) de los tumores y de ejercer un efecto citotóxico localizado6. Aunque se han investigado otros clostridios anteriores a C. novyi-NT por su efecto destructor de tumores, C. novyi-NT fue el primero en administrarse como esporas en lugar de bastoncillos vegetativos4. Además de ser relativamente no inmunogénico, la administración de C. novyi-NT en forma de esporas agrega una capa adicional de especificidad tumoral porque la germinación se ve favorecida dentro del microambiente tumoral hipóxico4,6. Las esporas, al estar latentes, también son resistentes al oxígeno que, de lo contrario, las mataría en su forma vegetativa6. Aunque las esporas son, por tanto, la forma clostridial ideal para la terapia tumoral, se sabe poco sobre lo que hace que una espora de C. novyi-NT germine, aparte del requisito de un entorno reductor. Además, lo que hace que C. novyi-NT sea un colonizador eficaz para algunos tumores pero no para otros sigue siendo un misterio7.

Nuestro conocimiento actual de las esporas bacterianas y la germinación se basa en gran medida en los géneros Bacillus y Clostridium8,9. En esencia, las bacterias esporulan cuando los recursos metabólicos son escasos, pero germinan cuando vuelven a prevalecer condiciones ricas en recursos. La capacidad de esperar pacientemente el regreso de las condiciones favorables en un estado latente encapsula la ventaja de supervivencia de las bacterias que esporulan. En las bacterias patógenas, este proceso cíclico impulsa la patogénesis, ya que una vez que las esporas benignas infectan sus entornos objetivo, germinan en sus formas vegetativas productoras de toxinas10,11,12. La germinación se puede dividir en dos etapas13. La primera etapa comienza con la interacción de los germinados de nutrientes de molécula pequeña con proteínas específicas llamadas receptores de germinación (GR). La activación de GR provoca la liberación de cationes monovalentes (H+, K+ y Na+) y dipicolinato de calcio (CaDPA), así como la hidratación parcial del núcleo de la espora. En la segunda etapa, la capa de corteza de esporas se hidroliza, lo que lleva a la expansión del núcleo y la hidratación completa, completando la transición desde la latencia. Posteriormente, el ADN, la síntesis de proteínas y las vías metabólicas clave se activan, lo que resulta en el crecimiento de la forma vegetativa14.

Se sabe que las esporas bacterianas germinan en respuesta a una amplia variedad de factores, como aminoácidos15, purinas16, azúcares17, sales biliares18 e iones19. Los germinantes son correlatos importantes de los entornos nutritivos y, por lo tanto, las bacterias esporuladoras han evolucionado para usarlos como señales para salir de la latencia de las esporas. La selección de germinantes se realiza típicamente detectando la germinación de esporas, señalada por una caída en la densidad óptica o la refractabilidad, en presencia de germinantes candidatos únicos. Sin embargo, los entornos reales de germinación son complejos y contienen múltiples factores que pueden potenciar o antagonizar el efecto de cualquier germinante putativo. Por ejemplo, las esporas de Clostridioides difficile germinan en presencia de la sal biliar taurocolato. Sin embargo, en el entorno intestinal, esta germinación puede ser antagonizada por otras sales biliares secundarias derivadas de microbios, como el litocolato y el ursodesoxicolato20. En el escenario opuesto, los germinados putativos que requieren interacciones positivas con otros factores en el medio ambiente podrían arrojar un resultado falso negativo cuando se evalúan como un solo candidato.

La selección de los germinantes candidatos individualmente, uno por uno, siempre dará una imagen incompleta si existen interacciones entre ellos. Por lo tanto, se necesita un enfoque que evalúe los factores de germinación en combinaciones porque la intuición tradicional de cambiar solo un factor a la vez se vuelve exponencialmente ineficiente a medida que aumenta el número de variables. En un enfoque de Diseño de Experimentos (DOE), múltiples factores se cambian simultáneamente de manera estructurada21. En el ámbito de la biología de las esporas, el DOE se ha utilizado para optimizar los componentes de los medios para la esporulación bacteriana22,23,24 y el cultivo25,26,27. En este estudio, usamos DOE para identificar los factores germinativos con los efectos más significativos, así como las interacciones entre ellos. Estos experimentos revelaron candidatos germinantes y cogerminantes, y además condujeron a la observación fortuita de D-valina y sus análogos como potentes germinantes de C. novyi-NT.

La Tabla complementaria 1 es un ejemplo de un diseño DOE, donde las filas representan experimentos independientes y las columnas representan factores probados. Cada fila prueba una combinación diferente de factores probados que están presentes (+) o ausentes (-). Cada columna tiene el mismo número de niveles + y −, y dos columnas elegidas al azar colocadas de forma adyacente tienen el mismo número de niveles emparejados (++, +−, −+ y −−). Por lo tanto, cada nivel (+ o -) de cada factor se asocia un número igual de veces con cada nivel (+ o -) de cada uno de los otros factores. Los niveles + y − de cualquier factor pueden compararse directamente entre sí, ya que ambos están sujetos exactamente al mismo fondo equilibrado de los otros factores. Usadas de esta manera, las pantallas del DOE estiman los factores más significativos entre una serie de factores candidatos utilizando un número eficiente de ejecuciones experimentales.

Caracterizamos los requisitos de germinación para C. novyi-NT de tres maneras, seleccionando germinantes primarios, cogerminantes e interacciones entre candidatos identificados (Fig. 1a). El diseño de Plackett-Burman (PB) (Tabla complementaria 1) se utilizó en experimentos iniciales en los que la cantidad de factores que se probaron fue alta (> 5). Una vez que este número se filtró a los progerminantes clave, se utilizó un diseño factorial completo (Tabla complementaria 2) para analizar cualquier interacción entre ellos. En todos los experimentos, la germinación se midió por la caída de la DO600 a lo largo del tiempo. Todas las lecturas positivas de germinación se verificaron por pérdida de refringibilidad bajo microscopía de contraste de fase. Primero se usaron altas concentraciones no fisiológicas en las pantallas de germinación para minimizar los falsos negativos. Los estudios de respuesta a la dosis se utilizaron posteriormente para estudiar los germinados examinados en concentraciones fisiológicas. En este estudio, todos los candidatos germinantes se catalogan en la Tabla complementaria 3, los términos técnicos utilizados en los gráficos DOE se definen en la Tabla complementaria 4 y todas las pruebas estadísticas realizadas se enumeran en la Tabla complementaria 5.

un esquema del enfoque de diseño de experimentos (DOE). b Se agregaron 20 L-aminoácidos en concentraciones en la Tabla complementaria 3 en diferentes combinaciones de acuerdo con el diseño de Plackett-Burman (PB) en la Tabla complementaria 1. La figura muestra las diferentes combinaciones ordenadas en orden decreciente (de arriba a abajo) de la respuesta de germinación expresado como ΔOD (columna de la extrema derecha) como se define en la Tabla complementaria 4. La figura también muestra el efecto (fila inferior) de cada L-aminoácido en el ΔOD, organizado en orden creciente de izquierda a derecha. Los factores resaltados en rojo y verde en los dos extremos de la matriz representan los L-aminoácidos con los efectos antagonistas y progerminativos más significativos, respectivamente (ɑ = 0,0005). Todos los datos se promediaron a partir de dos experimentos independientes con dos réplicas cada uno y representan valores medios de respuesta. c 20 L-aminoácidos al doble de las concentraciones en la Tabla complementaria 3 se agregaron individualmente por pocillo. Se muestra el diagrama de puntos de dispersión del grado de germinación para 20 L-aminoácidos como factores individuales (media ± SD), n = 4 muestras biológicamente independientes. La línea discontinua representa el umbral del 10 % para la germinación. Los L-aminoácidos se clasifican según su porcentaje de germinación (como se define en la Tabla complementaria 4), de mayor a menor de izquierda a derecha. El área sombreada en violeta resalta los L-aminoácidos que muestran una germinación significativa en comparación con la L-valina (prueba t no pareada, ****p < 0,0001). d Diagrama de Venn de importantes candidatos a favor de la germinación descubiertos a través de la pantalla PB (verde) y la pantalla de un solo factor (púrpura).

Los L-aminoácidos señalan la presencia de nutrientes y son los germinadores más comunes para las esporas bacterianas. Tomamos los 20 L-aminoácidos canónicos (Tabla complementaria 3) y probamos sus propiedades germinativas utilizando dos enfoques paralelos. En el primero, probamos combinaciones de L-aminoácidos usando un enfoque DOE específico llamado diseño de Plackett-Burman (PB)28. En el segundo, probamos cada L-aminoácido de forma independiente como se hace habitualmente.

¿Por qué realizar PB junto con una pantalla de germinación regular? Primero, una pantalla de PB identificaría no solo a los germinados sino también a los antagonistas de la germinación. La segunda razón tiene que ver con las interacciones. PB, que por diseño se basa en combinaciones de factores, arrojará resultados discrepantes con la pantalla de un solo factor si existen interacciones entre los factores. Esta es una limitación de PB cuando se utiliza para el objetivo principal de detección de factores independientes. Aquí, usamos intencionalmente esta propiedad para revelar la existencia de interacciones entre los L-aminoácidos. Después de todo, es concebible que puedan existir interacciones para hacer que un L-aminoácido germinante sea más o menos potente en presencia de otro L-aminoácido. Por el contrario, si no existieran interacciones, ambas pantallas deberían arrojar resultados idénticos.

Para la selección de PB, se construyeron 24 combinaciones de los 20 L-aminoácidos canónicos de modo que cada aminoácido estuviera presente en la mitad de las combinaciones y ausente en la otra mitad (Tabla complementaria 1). Un diseño de PB requiere que se pruebe solo una fracción de todas las 220 permutaciones posibles de L-aminoácidos, lo que permite realizar un solo experimento de PB con mediciones cinéticas de OD600 en una sola placa de microtitulación con cada pocillo correspondiente a una combinación. Se realizaron dos experimentos de PB (cada uno con dos réplicas por combinación), y la gráfica normal de los efectos estandarizados se muestra en la figura complementaria S1. Además, en la Fig. 1b se muestra una representación de datos más intuitiva del ΔOD para cada combinación y el efecto asociado con cada L-aminoácido. Las columnas muestran el rango de germinantes candidatos ordenados por su efecto asociado sobre la germinación, mientras que las filas muestran combinaciones de estos rangos de candidatos ordenados por respuesta de germinación. En este estudio, usamos el término 'pro-germinante' o 'factor pro-germinación' para referirnos a un factor que promueve la germinación, independientemente de si actúa de forma independiente (p. ej., como germinante primario) o en combinación (p. ej., como un co-germinante). A lo largo de las columnas, cuatro factores pro-germinativos (L-valina, L-cisteína, L-histidina y L-treonina), así como cuatro factores anti-germinativos (L-arginina, L-glicina, L-lisina y L- triptófano), se identificaron con efectos significativos (IC 99,95, ajuste del modelo R2 = 92,1 %). Dado que las filas representan combinaciones y están ordenadas de manera similar por la respuesta de germinación, uno esperaría que, si no hubiera interacciones, la fila que contiene cada germinante candidato se clasifique en la parte superior o cerca de ella. En cambio, vemos que la fila que contiene todos los candidatos está en la fila 11 de 24. Usando esta fila como referencia visual, los factores pro-germinación se enriquecen arriba de la fila 11 en la parte superior derecha. Por el contrario, los factores anti-germinación se enriquecen debajo de la fila 11 en la parte inferior izquierda. Esto concuerda con nuestra intuición de que restar los factores anti-germinantes de la fila 11 debería aumentar la respuesta de germinación, y estas combinaciones deberían clasificarse por encima de la fila 11. Por otro lado, restar los factores pro-germinantes de la fila 11 tendría el efecto opuesto por disminuyendo la respuesta de germinación, y estas combinaciones se clasificarían debajo de la fila 11. Estos resultados muestran que perdemos información importante al no tener en cuenta las interacciones. Paralelamente a la selección de PB, se realizó una selección de un solo factor con cada uno de los 20 L-aminoácidos evaluados de forma independiente como candidatos germinantes (Fig. 1c). Aquí, L-cisteína y L-alanina indujeron significativamente más del 10 % de germinación y se identificaron como germinantes.

Tomados en conjunto, tanto los resultados de PB como los de un solo factor muestran que las interacciones efectivamente modulan la actividad de los factores de germinación de maneras que no se reflejan en una pantalla típica de germinación de un solo factor (Fig. 1d). La L-cisteína fue el único germinante identificado en ambas pantallas, lo que demuestra que sus capacidades de germinación fueron efectivas incluso cuando se mezclaron con otros aminoácidos. Los germinantes restantes se identificaron ya sea en el PB o en la pantalla de un solo factor solo. La L-alanina, por ejemplo, se identificó solo en la pantalla de un solo factor, lo que sugiere que sus capacidades germinativas como agente único estaban enmascaradas por interacciones inhibitorias con otros aminoácidos. Finalmente, L-valina, L-histidina y L-treonina se identificaron como germinantes solo en la pantalla de PB. Esto muestra que ciertos L-aminoácidos, aunque inertes por sí mismos, probablemente pueden promover la germinación en presencia de otros factores en el medio ambiente.

A continuación, estudiamos las interacciones entre los 5 L-aminoácidos (Fig. 1d) identificados como que tienen un efecto positivo en la germinación al probar las 25 combinaciones de estos germinantes para interacciones entre ellos (Fig. 2a y Tabla complementaria 2). Similar a la figura 1b, las columnas de la figura 2a muestran los progerminantes clasificados por su efecto sobre la germinación y las filas muestran combinaciones de estos progerminantes clasificados por respuesta de germinación. En estos resultados, la L-cisteína ocupa las filas mejor clasificadas y está ausente de las filas inferiores. En resumen, solo se logra una alta respuesta de germinación si está presente la L-cisteína. El predominio de L-cisteína como progerminante en relación con los otros L-aminoácidos progerminantes también se refleja en la visualización alternativa en la Fig. 2b, que muestra la respuesta de germinación como una pendiente en lugar de un mapa de calor. El predominio de L-cisteína coincide con que es el único aminoácido identificado tanto en la pantalla de PB como en la pantalla de un solo factor. Esto quizás refleja que la L-cisteína tiene un fuerte efecto germinativo primario que no es fácilmente antagonizado por los otros L-aminoácidos. L-valina y L-alanina, por el contrario, fueron subcampeones más débiles (Fig. 2a, b). Profundizando más, preguntamos si había interacciones significativas entre los progerminantes de 5 L-aminoácidos. Los resultados de este análisis se muestran como una gráfica de interacción secundaria, que muestra la respuesta de germinación para cada posible par de aminoácidos cuando está presente o ausente (Fig. 2c). Cada gráfico en caja se encuentra en la intersección de dos etiquetas de aminoácidos, una en la misma fila que la caja (el "factor de fila") y la otra en la misma columna que la caja (el "factor de columna"). Dentro de cada gráfico de caja, la línea azul establece la respuesta de germinación de referencia para el factor de columna y la línea roja muestra la respuesta de germinación modificada cuando el factor de fila está presente. Si no hay interacciones, entonces el resultado esperado es que las líneas rojas y azules en cada gráfico de caja serán aproximadamente paralelas. Dado que esta es la observación en la Fig. 2c, la conclusión es que no hay interacciones fuertes entre los progerminantes de 5 L-aminoácidos.

Se realizaron experimentos factoriales completos con los factores pro-germinación (paneles a–c) y antagonistas de la germinación de L-cisteína (paneles d–f). Ambos diseños experimentales se detallan en la Tabla complementaria 2. Las concentraciones utilizadas fueron las mismas que en la pantalla de Plackett-Burman. a, d Las figuras representan las diferentes combinaciones de factores, ordenadas en orden decreciente (de arriba a abajo) de ΔOD (columna de la extrema derecha) como se define en la Tabla complementaria 4. El efecto (fila inferior) de cada L-aminoácido en ΔOD, también se muestra en orden creciente de izquierda a derecha. b, e Gráfico de interacción principal de L-aminoácidos pro-germinativos (líneas azules con círculos, modelo ɑ = 0.0001) y L-aminoácidos antagonistas con L-cisteína (líneas rojas con círculos, modelo ɑ = 0.001) respectivamente mostrando el promedio de ΔOD para cada concentración de aminoácido. c, f Gráfica de interacción secundaria que muestra las interacciones entre todos los pares de factores. Las líneas azules con círculos representan la ausencia y las líneas rojas con círculos representan la presencia de los L-aminoácidos indicados. Todos los datos se promediaron a partir de dos experimentos independientes con dos réplicas cada uno y representan valores medios de respuesta. Las pendientes positivas indican efectos positivos sobre la germinación, mientras que las pendientes negativas indican efectos inhibitorios.

Dado que la pantalla de PB también había identificado aminoácidos que negaban la germinación, usamos el mismo conjunto de análisis factoriales completos para estudiar el efecto de estos 4 factores negativos (glicina, L-arginina, L-lisina y L-triptófano) en L -germinación inducida por cisteína. En el mapa de calor factorial completo, se puede ver que la L-cisteína es necesaria pero insuficiente para una fuerte respuesta de germinación (Fig. 2d). La L-cisteína está presente en las 4 filas superiores donde ocurre la única germinación significativa. El efecto germinativo de la L-cisteína se reduce a cero cuando están presentes la L-arginina o la L-glicina. La visualización alternativa en la Fig. 2e confirma esta observación y además revela una interacción más débil con L-lisina. Esta intuición se ve reforzada por la gráfica de interacción secundaria (Fig. 2f), que muestra líneas azules y rojas no paralelas para gráficos de cajas múltiples. Como era de esperar, se observa una desviación del paralelo para los gráficos de 4 cajas relacionados con L-cisteína + L-glicina y L-cisteína + L-arginina. Además, también hay desviaciones del paralelo para los gráficos de 2 cajas relacionados con L-arginina y L-glicina. En ambos gráficos, la ausencia tanto de L-arginina como de L-glicina está asociada con una alta germinación provocada por la L-cisteína. Sin embargo, la presencia de L-arginina o L-glicina o de ambas no da como resultado la germinación. Los análisis factoriales completos anteriores implican que los aminoácidos inhibidores en el entorno natural pueden actuar como modificadores antagónicos del fuerte efecto progerminante de la L-cisteína. Curiosamente, el L-triptófano, que tuvo un efecto inhibitorio en la pantalla de PB, mostró un efecto ligeramente positivo en la germinación. Por lo tanto, el efecto de ciertos aminoácidos en la germinación puede ser muy contextual, lo que enfatiza la necesidad de sondear el espacio combinatorio de los candidatos a germinar.

Luego probamos derivados de purina, que son la siguiente clase de germinación más común para las esporas bacterianas después de los L-aminoácidos. Los candidatos de purina se probaron en paralelo utilizando las pantallas factoriales completas y de un solo factor, pero no se encontró que ninguna desencadenara la germinación en ninguna de las pantallas (Figuras complementarias S2a-S2c). Dado que se sabe que las purinas actúan como cogerminantes29 y que el número de purinas analizadas fue bajo, diseñamos una pantalla factorial completa con todas las combinaciones posibles de 5 purinas. Se utilizó como condición de referencia una concentración de L-cisteína subóptima insuficiente para desencadenar la germinación completa. Cualquier actividad co-germinante de L-cisteína sería por lo tanto revelada por una mayor caída en OD600. Los resultados demuestran inequívocamente que tanto la hipoxantina como la inosina son cogerminantes potentes para la germinación mediada por L-cisteína, mientras que la adenosina, la xantina y la xantosina inhiben la germinación (Fig. 3a, b). La gráfica de interacción secundaria (Fig. 3c) revela además líneas no paralelas para las gráficas entre hipoxantina e inosina. Aquí, la hipoxantina o la inosina por sí solas son suficientes como cogerminantes para desencadenar una fuerte germinación, y la extensión de la germinación no mejora con la presencia de ambos. También son notables los gráficos no paralelos menos dramáticos para hipoxantina frente a adenosina e hipoxantina frente a xantosina. Estos muestran que el efecto progerminante de la hipoxantina es ligeramente antagonizado por la adenosina y la xantosina.

La respuesta de germinación se midió en presencia de L-cisteína (10 mM) para todas las combinaciones de purinas (0,1 mM) de acuerdo con el diseño factorial detallado en la Tabla complementaria 2 (paneles a-c). a La figura muestra las diferentes combinaciones de purinas en presencia de L-cisteína germinante principal, ordenadas en orden decreciente (de arriba a abajo) de ΔOD (columna de la extrema derecha) como se define en la Tabla complementaria 4. La figura también muestra el efecto (fila inferior ) de cada purina en ΔOD, dispuestas en orden creciente de izquierda a derecha. b Gráfica de interacciones principales para los cinco análogos de purina (líneas azules con círculos, modelo ɑ = 0,0005). c Gráfica de interacción secundaria que muestra las interacciones entre todos los pares de factores. Las líneas azules con círculos representan la ausencia y las líneas rojas con círculos representan la presencia de las purinas indicadas. d Estructuras de los cinco análogos de purina. Un anillo de purina reducido que presenta un doble enlace C2-N3 (flecha verde) está asociado con la germinación. Todos los datos se promediaron a partir de dos experimentos independientes con dos réplicas cada uno y representan valores medios de respuesta.

Para comprender si estos efectos cogerminantes dependían del contexto, probamos estas mismas 5 purinas solas, es decir, no en combinaciones (Figura complementaria S2c). Aquí, encontramos que la hipoxantina y la inosina aún mostraban fuertes efectos de cogerminación, lo que corrobora el experimento factorial completo anterior. Además, sin embargo, la adenosina también exhibió un efecto cogerminante significativo, en contraste directo con su efecto inhibitorio en el experimento factorial completo. Tales efectos contextuales para la adenosina no tienen precedentes. Por ejemplo, la adenosina inhibe la germinación provocada por la inosina de las esporas de Bacillus cereus mientras actúa simultáneamente como cogerminante con L-alanina30. En el caso de C. novyi-NT, parece que la adenosina puede actuar como un potente cogerminante en ausencia de otras purinas, pero tal vez no de otro modo.

Al comparar las estructuras de las purinas probadas con la actividad de germinación, observamos que la hipoxantina, la inosina y la adenosina comparten la forma reducida del anillo de purina, que presenta un doble enlace entre N3 y C2, que puede ser importante para la actividad cogerminante ( Figura 3d). La xantosina y la xantina, por otro lado, comparten la forma de purina oxidada, presentando un carbonilo en C2 que puede explicar su actividad inhibidora. Estas observaciones son correlacionales y requieren más estudios de estructura-actividad para establecer la causalidad.

Los receptores de germinación a menudo son estereoespecíficos en su reconocimiento de los L-aminoácidos germinantes, con un estereoisómero desencadenando la germinación y el otro inhibiéndola. Bacillus subtilis es un ejemplo clásico, donde la germinación inducida por L-alanina es inhibida por D-alanina31. Nos preguntamos si la germinación por L-cisteína, L-alanina y L-valina podría ser antagonizada por sus socios estereoisoméricos, posiblemente dando pistas sobre la jerarquía de la señalización de la germinación.

Para responder a esta pregunta, se midieron las respuestas de germinación a estos tres factores en presencia o ausencia de D-cisteína, D-alanina y D-valina. Todos los germinados fueron fuertemente inhibidos por D-alanina, lo que demuestra que estos germinados actuaron a través de vías de señalización y no de estímulos fisicoquímicos (Fig. 4a, b). La D-cisteína también mostró un efecto inhibidor, pero para un subconjunto de germinantes (L-cisteína y L-valina). El efecto inhibidor de la D-alanina fue eficaz incluso en medios complejos, lo que demuestra su función potencial como interruptor inhibidor maestro. (Figura 4c). La D-cisteína, en comparación, permitió la germinación en medios complejos. En los casos en que la D-alanina inhibe la germinación de esporas en otras bacterias, a menudo está presente en el peptidoglicano de esporas o se libera durante la germinación como una forma de minimizar la germinación prematura, un fenómeno denominado autoinhibición32,33. El análisis de LC-MS mostró que este es el caso con C. novyi-NT, con D-alanina presente en el peptidoglicano de las esporas latentes y germinadas, así como en las bacterias vegetativas, aunque no se liberó activamente en el medio durante la germinación. (Figura 4d). Las imágenes de las esporas utilizadas en el análisis LC-MS se muestran en la figura complementaria S3.

un diagrama de puntos de dispersión del porcentaje de germinación (como se define en la Tabla complementaria 4) por germinantes de L-aminoácidos (91,5 mM) en presencia de inhibidores de D-aminoácidos candidatos (91,5 mM). Los círculos verde, rojo y azul se refieren a L-cisteína, L-alanina y L-valina, respectivamente. Todos los datos representan la media ± SD, n = 4 muestras biológicamente independientes. Significación en ****p ≤ 0,0001 (prueba t no pareada). b Cuadro resumen de resultados de (a). c Imágenes de contraste de fase de esporas inoculadas durante la noche en medio RCM-FBS oxirasa que contiene D-alanina (93,5 mM), D-cisteína (93,5 mM) y agua. Las imágenes son el mejor representante de dos experimentos independientes. Ampliación 1600×, barra de escala 2 µm. d Espectros LC-MS EIC del ion alanina derivatizado (351 m/z) para estándares de L-alanina, D-alanina y muestras de extractos de peptidoglicano de esporas latentes, esporas germinadas, bacterias vegetativas y sobrenadantes de esporas germinadas en L-cisteína , L-alanina, L-valina o D-valina. Las líneas punteadas representan picos estándar para L-alanina y D-alanina en tiempos de retención de 13,4 y 14,05 min, respectivamente. Los datos que se muestran son los mejores representativos de los espectros sustraídos del blanco de agua de dos experimentos independientes.

El inhibidor candidato final, D-valina, no inhibió ninguno de los germinantes, y todo lo contrario, incluso pareció agregarse a la germinación de referencia inducida por L-valina (Fig. 4a).

Intrigados por los resultados de D-valina, realizamos una pantalla de germinación de un solo factor en un panel de 19 D-aminoácidos. Para nuestra sorpresa, D-valina de hecho podría desencadenar la germinación de esporas de C. novyi-NT y fue el único D-aminoácido que pudo hacerlo (Fig. 5a). Las esporas germinadas de D-valina aparecieron en fase oscura bajo microscopía de contraste de fase, lo que confirma este resultado inicial (Fig. 5b).

una pantalla de factor único para 19 D-aminoácidos donde cada D-aminoácido se analizó individualmente para la germinación en las concentraciones en la Tabla complementaria 3. La línea discontinua representa un umbral de germinación del 10%. Los D-aminoácidos se clasifican en orden decreciente de % de germinación de izquierda a derecha. Significativo a ****p ≤ 0,0001 (prueba t no pareada) en comparación con D-treonina. b Imagen de contraste de fase de esporas de C. novyi-NT germinadas con D-valina (45,7 mM) con un aumento de 1000x. Barra de escala de 5 µm. c Curva de respuesta a la dosis para la respuesta de la germinación a diferentes concentraciones de D-valina (negra), L-cisteína (verde), L-alanina (roja) y L-valina (azul) normalizadas a la germinación con D-valina en la concentración más alta 91,5 mM. Los círculos representan valores individuales. Las líneas sólidas representan la curva de regresión de ajuste de mínimos cuadrados. El área sombreada muestra las bandas de error de confianza del 95% para cada ajuste de L-aminoácido. Los valores de EC50 se muestran en la leyenda y son significativos en ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01 (prueba t no pareada) en comparación con D-valina. d Germinación por D-valina (91,5 mM) en presencia de otros D- y L-aminoácidos (91,5 mM). Significativo a ****p ≤ 0,0001 (prueba t no pareada) en comparación con el control DIW. e Espectros LC-MS EIC del ion valina derivatizado (379 m/z) para estándares de L-valina, D-valina y muestras de extractos de peptidoglicano de esporas latentes, esporas germinadas, bacterias vegetativas y sobrenadantes de esporas germinadas en L-cisteína , L-alanina, L-valina o D-valina. Los datos que se muestran son los mejores representativos de los espectros sustraídos en blanco de agua de dos experimentos independientes. Las líneas punteadas representan los picos estándar de L-valina (20,34 min) y D-valina (20,73 min) respectivamente. Todos los datos de germinación representan la media ± SD, n = 4 muestras biológicamente independientes. El porcentaje de germinación para todos los gráficos se define en la Tabla complementaria 4.

La cinética de la germinación de D-valina, medida por la liberación de OD y ácido dipicolínico (DPA), fue similar a la L-cisteína y la L-alanina (Fig. S4 complementaria). También resulta que se requerían concentraciones significativamente más bajas de D-valina para desencadenar la germinación en comparación con L-cisteína o L-alanina, lo que demuestra que la D-valina era más potente como germinante (Fig. 5c). Al igual que la L-cisteína y la L-valina, la D-cisteína y la D-alanina podrían inhibir la germinación de la D-valina, lo que proporciona más pruebas de que la D-valina es un germinador de buena fe (Fig. 5d).

La observación de que la D-valina puede desencadenar de forma independiente la germinación de C. novyi-NT va en contra de la intuición general de que los L-aminoácidos promueven la germinación mientras que los D-aminoácidos la inhiben. Específicamente, no se ha demostrado previamente que la D-valina desempeñe ningún papel activo en la germinación de esporas bacterianas. ¿Podría la D-valina desempeñar un papel como molécula de señalización y, de ser así, cuál era la fuente de esta D-valina? Dado que la mayoría de las bacterias incorporan D-aminoácidos (principalmente D-alanina, D-glutamina y, a veces, D-valina) en su peptidoglucano durante la fase estacionaria34, nos preguntamos si la D-valina podría ser un componente de la capa de peptidoglucano de la corteza de la espora34,35 ,36,37. Para abordar esta pregunta, la capa de peptidoglicano de esporas latentes, esporas germinadas y bacterias vegetativas se extrajo, hidrolizó y analizó mediante derivatización LC-MS (Fig. 5e y Fig. S3 complementaria). Este análisis reveló que la D-valina no estaba presente en el peptidoglucano de las formas de esporas o vegetativas, aunque la L-valina estaba presente en ambas (Fig. 5e). Además, la D-valina estuvo ausente del sobrenadante de las muestras de esporas germinadas de L-cisteína o L-alanina o L-valina (Fig. 5e y Fig. S3 complementaria), lo que demuestra que la D-valina no era un constituyente del peptidoglicano de la espora, ni liberado durante la germinación. Es concebible que pueda haber una racemasa específica de D-valina en las esporas de C. novyi-NT que genera L-valina. Sin embargo, no se detectó L-valina en esporas germinadas con D-valina, lo que hace que esto sea poco probable (Fig. 5e).

Dado que se demostró que la espora no es una fuente de D-valina, y dada la supuesta escasez de D-valina en tejidos de mamíferos colonizados por C. novyi-NT, preguntamos si un análogo de D-valina podría ser el germinante relevante real. . Examinamos una colección de análogos de D-valina (Fig. S5 complementaria) y descubrimos 5 análogos que mostraron actividad germinativa (Fig. 6a). Curiosamente, 4 de estos análogos comprendían dos pares de estereoisómeros; L-norvalina y D-norvalina, así como ácido L-2-aminobutírico (L-AABA) y ácido D-2-aminobutírico (D-AABA). Estos dos pares reflejan nuestra observación con valina, con los enantiómeros L y D mostrando actividad germinativa. Dado que se había demostrado previamente que D-alanina y D-cisteína inhibían la germinación por L- y D-valina, realizamos el mismo experimento y observamos que D-alanina y D-cisteína también podían inhibir la germinación inducida por los análogos de valina ( Figura 6b). Esto sugiere que estos análogos actúan a través de la misma vía de señalización que la L- y D-valina, posiblemente actuando a través del mismo receptor germinativo. L-AABA y D-norvalina, los germinantes más fuertes entre los análogos, tienen una potencia similar a la L-cisteína (Fig. 6c).

una pantalla de factor único de análogos estructurales estereoisoméricos de D-valina. Todos los análogos estaban a una concentración de 91,5 mM. Se usaron D-valina y L-valina como controles positivos de referencia (gris). Todos los análogos de valina con germinación >10% (verde) se identificaron como germinantes. Significativo en ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01,*p ≤ 0,05, ns p > 0,05 (prueba t no pareada) en comparación con el ácido 4-aminobutírico. b Respuesta de germinación de análogos de valina (91,5 mM) Ácido L-2-aminobutírico (círculos naranjas), ácido D-2-aminobutírico (círculos rosas), L-norvalina (círculos verde oscuro), D-norvalina (círculos morados), S -(3)-ácido aminobutírico (círculos grises) en presencia de los inhibidores D-cisteína y D-alanina (concentración 91,5 mM). Significativo a ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01,*p ≤ 0,05, ns p > 0,05 (prueba t no pareada) en comparación con los controles de agua correspondientes. c La curva de respuesta a la dosis para la respuesta de germinación a diferentes concentraciones de ácido L-2-aminobutírico (naranja), D-norvalina (púrpura) y L-cisteína (verde) (normalizada para la germinación con D-valina en la concentración más alta 91,5 mM) muestra potencia de los análogos de valina similar a la L-cisteína. Los círculos representan valores individuales. Las líneas sólidas representan la curva de regresión de ajuste de mínimos cuadrados. El área sombreada muestra las bandas de error de confianza del 95 % para cada ajuste de aminoácido. Los valores EC50 se muestran en la leyenda. d Marco de señalización de dos componentes propuesto para la germinación de C. novyi-NT. Todos los datos de germinación representan la media ± SD, n = 4 muestras biológicamente independientes. El porcentaje de germinación para todos los gráficos se define en la Tabla complementaria 4.

Nos preguntamos si tal vez la valina, AABA y norvalina eran metabolitos en la C. novyi-NT vegetativa. Los metabolitos de las formas de varillas germinadas teóricamente podrían servir como germinantes para impulsar aún más la germinación de las esporas. El análisis de LC-MS para valina y norvalina se realizó en varillas cultivadas en medio líquido y mostró que ambos estaban ausentes de C. novyi-NT vegetativo peletizado y medios condicionados por su crecimiento (Fig. S6a complementaria). Por razones técnicas, se realizó el mismo análisis LC-MS para AABA en colonias cultivadas en medio de agar. Aquí, se observó que L-AABA estaba presente en las varillas C. novyi-NT, pero D-AABA estaba ausente (Fig. S6b complementaria). Además de ser un metabolito putativo de C. novyi-NT, L-AABA también es un marcador no específico de sepsis38, así como un metabolito producido por otros clostridios necrosantes similares como C. botulinum y C. sordelli39,40, por lo tanto también implicando al medio ambiente como una fuente potencial de L-AABA. Estos hallazgos sugieren que los D-aminoácidos y sus análogos pueden desempeñar funciones aún no descubiertas en la germinación de esporas bacterianas.

El DOE ha jugado un papel importante en este estudio. Solo L-cisteína y L-alanina se habrían identificado como germinantes en una pantalla de un solo factor. La combinación de DOE con análisis de un solo factor condujo al descubrimiento adicional de progerminantes e inhibidores que actúan solo en combinación, e impulsó la secuencia de investigaciones que identificaron a la D-valina y sus análogos como progerminantes de buena fe. Los efectos de los factores individuales que actúan de forma independiente pueden desviarse de los efectos de los factores en combinación y, por lo tanto, esperamos que esta herramienta encuentre un uso más común en los estudios de germinación de esporas bacterianas. Especialmente, tales interacciones entre factores existirían en el mundo real habitado por la espora y DOE representa una forma eficiente de probar y comprender el espacio combinatorio de manera más eficiente.

En este primer uso de DOE en una pantalla para germinantes de esporas bacterianas, hemos identificado los principales efectos germinativos para C. novyi-NT. Si bien aún no se puede describir completamente una ruta completa, hay suficiente información para inferir un marco rudimentario para la secuencia de eventos de señalización de germinación (Fig. 6d). Este marco puramente hipotético se basa en la tabla de resumen de factores de la Fig. 6d, y deberá revisarse a medida que se disponga de más datos experimentales. En este marco, hay dos elementos de marcador de posición A y B, que agregan señales de germinantes e inhibidores. Aquí, B está aguas abajo de A, y la germinación es aguas abajo de B. Dado que la D-alanina inhibe todos los germinantes, es más probable que actúe sobre B, que es el elemento más aguas abajo. La inhibición de la D-cisteína, por el contrario, no es absoluta y, por lo tanto, proponemos que podría actuar aguas arriba sobre el elemento A. Utilizando un razonamiento similar, los germinantes inhibidos por la D-cisteína (L-cisteína; L/D-valina y sus análogos) también actuaría sobre el mismo elemento A. Finalmente, dado que la L-alanina escapa a la inhibición de la D-cisteína pero no a la D-alanina, puede actuar sobre el elemento aguas abajo B.

A y B son marcadores de posición para los participantes en la señalización germinativa que aún no se han identificado. Ambos podrían representar participantes de señalización únicos o múltiples, y estos participantes posiblemente podrían derivar de dos conjuntos de operones de germinación (NT01CX_0189-0191 y NT01CX_0562-564) dentro del genoma C. novyi-NT41. En particular, NT01CX_0191, NT01CX_0562 y NT01CX_0564 muestran similitudes de secuencia altas con los genes de la familia de receptores germinales en B. cereus y C. botulinum (Tabla complementaria 6) y, por lo tanto, son candidatos interesantes para futuras investigaciones.

Entre todas las clases de germinantes, solo los L-aminoácidos se presentan universalmente en todas las esporas bacterianas conocidas como factores progerminantes. El reconocimiento de los aminoácidos germinantes se ve facilitado por los receptores de tipo Ger, que están presentes en casi todos los Clostridium y Bacillus en esporulación42. Una rara excepción a esta regla es C. difficile, que utiliza el receptor de tipo Csp (CspA)43,44. Como era de esperar, todos los estudios de germinación con Clostridium han identificado al menos un aminoácido como progerminante (es decir, germinante o cogerminante)45. ¿Cómo se comparan los factores progerminantes de aminoácidos para C. novyi-NT con otros clostridios? En una encuesta de 14 clostridios (incluido C. novyi-NT de este estudio), la L-alanina (10/14) fue el progerminante más común seguido de la L-cisteína (7/14) (Tabla complementaria 7). C. novyi-NT sigue esta popular tendencia al utilizar estos dos L-aminoácidos como progerminantes. Además de estos dos L-aminoácidos, los clostridios también presentan otros L-aminoácidos como factores pro-germinantes con menor frecuencia. C. novyi-NT no es diferente y muestra una respuesta de germinación a la L-valina. C. novyi-NT también germina en respuesta a germinantes no canónicos que no son L-aminoácidos clásicos, como L-norvalina y ácido L-2-aminobutírico. En este sentido, son similares a C. frigidicarnis que responde a L-norvalina46, y C. difficile que responde tanto a L-norvalina como a L-2-aminobutírico ácido47. El ácido L-2-aminobutírico puede tener importancia metabólica como germinante nutritivo, ya que se produce como un metabolito intracelular en C. novyi-NT vegetativo. Una posibilidad es que la germinación del ácido L-2-aminobutírico actúe como retroalimentación positiva de las esporas de germinación temprana para estimular una mayor germinación. Además, la similitud estructural del ácido L-2-aminobutírico con la L-norvalina y la L-valina significa que los tres podrían unirse al mismo receptor de germinación (Fig. S5 complementaria). Se necesita más investigación para arrojar luz sobre estas hipótesis.

Hasta la fecha, prácticamente todos los progerminantes de aminoácidos informados para clostridios son L-aminoácidos. Los únicos clostridios que se desvían de esta tendencia son C. bifermentans (que utiliza D-alanina, D-arginina y D-serina como cogerminantes)48,49, C. difficile (que utiliza D-alanina o D-serina como a co-germinantes)50, y con este estudio, C. novyi-NT (que germina en respuesta a D-valina y sus análogos). Dado que C. bifermentans, C. difficile y C. novyi-NT son los únicos clostridios que conocemos en los que los paneles de D-aminoácidos se examinaron para detectar actividad progerminante, la verdadera incidencia de D-aminoácidos germinantes entre los clostridios es muy probable que sea subestimado.

Es común que los D-aminoácidos puedan actuar como inhibidores de la germinación, porque los L-aminoácidos germinados individuales normalmente son antagonizados por sus imágenes especulares de D-aminoácidos. Por lo tanto, nos sorprendió descubrir que no solo la D-valina no logró antagonizar la germinación de la L-valina, sino que la D-valina resultó ser un germinante aún más potente que la L-valina. Otra observación inesperada fue que la D-alanina impedía que las esporas germinaran en Medio Clostridial Reforzado, un medio de cultivo rico en complejos. Empíricamente, los D-aminoácidos pueden inhibir una gama más amplia de germinantes que solo sus homólogos de L-aminoácidos. Tomando C. sporogenes como ejemplo, se ha demostrado que la D-serina inhibe la germinación a L-serina y, además, a L-cisteína, L-metionina y L-fenilalanina51. La D-alanina, que también ha demostrado inhibir la germinación en Bacillus thiaminolyticus a L-glutamina, L-norvalina, L-serina, L-metionina y L-treonina, no es diferente52. A pesar de estos ejemplos, ningún estudio previo ha mostrado la inhibición aparentemente absoluta de la germinación que se observa con la D-alanina en este estudio. Una posibilidad podría ser la escasez de estudios que prueben la inhibición de la D-alanina en medios ricos en complejos. Otra explicación es que la señalización de germinación en C. novyi-NT puede converger en un único guardián, mientras que la naturaleza de la señalización de germinación puede ser más paralela en otros clostridios, con múltiples rutas redundantes para desencadenar la germinación.

Si bien los detalles de la germinación de C. novyi-NT aún no se han desarrollado, este trabajo destaca dos temas generales. En primer lugar, los factores de germinación pueden actuar con un alto grado de independencia (como L-cisteína y D-alanina), o de manera interdependiente (como L-alanina o L-treonina). Si bien nos hemos acostumbrado a pensar en los germinadores de esporas como actores solitarios, nuestros datos demuestran que las propiedades germinativas de ciertos aminoácidos pueden surgir o desaparecer dependiendo de la presencia de otros aminoácidos. La pantalla PB en nuestro estudio puede mostrar la existencia de interacciones, pero no está diseñada para explorar estas interacciones en gran detalle. Por lo tanto, se necesita más trabajo para dilucidar la naturaleza de estas interacciones.

La estereoflexibilidad es el segundo tema. La naturaleza es exigente con la quiralidad y, por lo tanto, los receptores de germinación de esporas normalmente reconocen L-aminoácidos específicos como sus germinantes afines. Los enantiómeros de D-aminoácidos de estos germinados pueden, por otro lado, interrumpir estas interacciones, inhibiendo así la germinación51. Es posible que deba revisarse este modelo homoquiral simple y elegante a la luz de nuevas investigaciones que muestran que la D-serina y la D-alanina pueden actuar como cogerminantes para C. difficile50,53. En esa investigación, la inactivación genética de alr2, una alanina racemasa, anuló la actividad cogerminante de estos D-aminoácidos, lo que demuestra que la conversión a la forma L era esencial para la actividad germinativa. Aunque una actividad de racemasa que involucra la conversión de D-valina a L-valina actividad de racemasa teóricamente podría explicar la estereoflexibilidad de C. novyi-NT, dicha actividad de racemasa no se detectó en este estudio. Alternativamente, también es posible que haya un receptor germinativo en C. novyi-NT que se una a los aminoácidos de manera estereoflexible. Ciertamente hay una necesidad de más investigación para eliminar la ambigüedad entre estas posibles explicaciones. A diferencia de C. difficile, la D-valina y sus análogos no actúan como cogerminantes sino como germinantes primarios en C. novyi-NT, con efectos de germinación que rivalizan con la L-cisteína, el principal L-aminoácido germinante. Estos datos plantean una evidencia aún más fuerte de que el modelo homoquiral está incompleto.

Razonando a partir de los primeros principios, el vocabulario germinativo de una bacteria formadora de esporas determina el nicho que habita. Por lo tanto, es razonable esperar que la detección de germinación no se base en unos pocos nutrientes clave, sino en una detección multiplexada del medio ambiente. Las interacciones complejas y la detección estereoflexible pueden ser las llaves que abren la puerta al verdadero vocabulario germinativo de las esporas bacterianas. También pueden sentar las bases para comprender y mejorar la capacidad de colonización de tumores de C. novyi-NT.

Los tumores sólidos están pobremente vascularizados y contienen regiones de hipoxia y necrosis54. Esta propiedad se correlaciona con peores resultados para la radioterapia y la quimioterapia, pero también presenta una oportunidad terapéutica para que las esporas de clostridios estrictamente anaerobios colonicen y eliminen las células cancerosas55. Sin embargo, no todos los clostridios son iguales para este propósito. Aunque todos son anaerobios obligados, en un estudio se encontró que solo dos de las ocho cepas analizadas (C. novyi-NT y C. sordelli) colonizaron eficazmente las regiones hipóxicas de los tumores experimentales4.

Un factor que podría influir en la eficacia de la colonización es la medida en que los germinantes clave están presentes en el microambiente del tumor. En este sentido, varios factores progerminativos de C. novyi-NT están bien enriquecidos en tumores sólidos. Se ha demostrado que la L-cisteína intratumoral, por ejemplo, alcanza hasta 1,40 mM en ciertos tumores56, superando la línea base promedio de ~0,2 mM en plasma57. Se cree que el aumento de los niveles de cisteína intratumoral protege a las células cancerosas de los efectos de la radioterapia58 y la quimioterapia59, pero también puede promover potencialmente la germinación de C. novyi-NT dentro de estos nichos resistentes al tratamiento. De hecho, C. novyi-NT requiere solo 1 mM de L-cisteína en combinación con cualquiera de los cogerminantes (hipoxantina o inosina) para lograr una germinación débil (Fig. S2d complementaria).

Además de L-cisteína, los cogerminantes, hipoxantina e inosina, están igualmente enriquecidos en tumores60,61. Ambos son sustratos en las vías metabólicas de las purinas que impulsan la proliferación de células cancerosas y se liberan de las células moribundas en el tejido necrótico y putrefacto. Hasta ahora no se sabe que la hipoxantina promueva la germinación de esporas bacterianas. La inosina, por otro lado, está asociada con otras bacterias colonizadoras de tejidos ya sea como germinante (B. cereus29, Bacillus anthracis62), o como cogerminante (Clostridium botulinum tipo E63). En conjunto, es probable que las concentraciones tumorales de L-cisteína, hipoxantina e inosina tengan un efecto importante sobre la colonización y podrían contribuir a la variación en la germinación observada entre diferentes pacientes con cáncer tratados con esporas de C. novyi-NT64.

Ahora que tenemos una imagen más completa de cómo germinan las esporas de C. novyi-NT, podemos inducir potencialmente la germinación de esporas en tumores que anteriormente no respondían, logrando así resultados más consistentes en diferentes tumores sólidos. Además, la ingeniería de cepas de C. novyi-NT que son más sensibles a uno o más de sus germinantes puede aumentar aún más el efecto terapéutico de esta prometedora terapia contra el cáncer.

Todos los L-aminoácidos, D-aminoácidos (excepto D-histidina), purinas, análogos de valina, cloruro de terbio (212903), maltosa (M5895), fosfato de sodio dibásico (S7907), o-ftaldialdehído (P0657), N-acetilo cisteína (A7250), tetraborato de sodio decahidratado (B3545), metanol de grado HPLC (34860), 1-propanol (34871), ácido trifluoroacético (302031) y enzima mutanolisina (M9901) se adquirieron de Sigma. El 2-propanol (29113-95) se obtuvo de Nacalai Tesque. D-histidina (sc-255057) se adquirió de SantaCruz Biotechnology. El acetonitrilo (1,00317) y el HCl (1,00029) se adquirieron de Merck. Percoll (17089109) se adquirió de GE Healthcare. Oxyrase para caldo se adquirió de Oxyrase Inc y Sigma (SAE0013). La peptona de polipeptona BBL (211910), el medio de carne cocida deshidratada (226730), el caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI, 237500) y el medio de clostridio reforzado (RCM, 218081) se adquirieron de BD. El suero bovino fetal (S1810) se obtuvo de iDNA Biotechnology.

C. novyi-NT fue un regalo del laboratorio Kinzler-Vogelstein en la Universidad John Hopkins, EE. UU.

Las esporas de Clostridium novyi-NT se prepararon utilizando el protocolo de Cheong et al.5. Brevemente, se inocularon 200 µl de 5 × 109 CFU/ml de esporas de C. novyi-NT en 1 l de medio de esporulación rico en polipeptona y carne cocida (L-cisteína 0,5 g/l, Fosfato de sodio dibásico o Na2HPO4 5 g/l, BBL polipeptona peptona 30 g/l, medio de carne cocida deshidratada 50 g/l, maltosa 10 g/l y FBS 10 % v/v) y el cultivo se esporuló dentro de un frasco anaeróbico BD GasPakTM sellado y se incubó a 37 °C durante tres semanas. Las esporas se recogieron resuspendiendo el sedimento en PBS 1X y separando las esporas de las células vegetativas utilizando una solución de Percoll al 90 % a 15000 rcf durante 30 min en una centrífuga de alto rendimiento Beckman Avanti J-20 XP. La calidad de las esporas se comprobó mediante microscopía de contraste de fase y se encontró que contenía >99 % de esporas de fase brillante. La concentración de esporas se ajustó a 5 × 10 ^{9} CFU/ml mediante la dilución apropiada en 1 × PBS usando una curva estándar que correlacionaba la absorbancia de OD600 con el recuento de células.

Todos los experimentos de germinación de esporas se realizaron anaeróbicamente usando oxirasa para la enzima del caldo en una placa de micropocillos transparente Greiner Bio-One 384 (#781186). Las condiciones anaeróbicas por sí solas no desencadenaron ninguna germinación. A 50 µl de solución germinante que contenía oxirasa (1:50 v/v) y germinantes en diferentes combinaciones como se describe a continuación, se añadieron 3,5 µl de 5 × 109 CFU/ml de esporas de C. novyi-NT en 1 × PBS. La placa se hizo hermética con una película de sellado Sealplate y se incubó a 37 °C durante la noche. La lectura de OD600 se midió utilizando un lector de microplacas multimodo Tecan Spark® cada 10 min a través del software Spark Control Dashboard V2.2.

Todas las respuestas de germinación de punto final se calcularon aproximadamente en el tiempo t = 7,3 h. Todos los análisis de diseño de detección del DOE se realizaron con Minitab 20. Los parámetros de ajuste del modelo para todos los experimentos del DOE se muestran en la Tabla complementaria 8. La respuesta de germinación para todos los experimentos del DOE y los experimentos de germinación basados ​​en un solo factor se calcularon como se especifica en la Tabla complementaria 4.

El diseño de Plackett-Burman es un diseño de detección factorial fraccional de dos niveles que usa concentraciones de nivel alto y bajo para estudiar variables N-1 usando combinaciones N, donde N es un múltiplo de 4. Para los 20 L-aminoácidos, una combinación de 24 El diseño de Plackett-Burman usando Minitab19 se generó como se muestra en la Tabla complementaria 1 y se configuró en una placa de microtitulación de 384 pozos usando la estación de trabajo automatizada Biomek i5, donde cada pozo constaba de una combinación particular de todos los 20 L-aminoácidos preparados a partir de una mezcla maestra de acuerdo con cada fila en la Tabla complementaria 1. Los 20 L-aminoácidos se prepararon en altas concentraciones de stock, que cuando se diluyeron por un factor de 20 y se mezclaron con las esporas dieron concentraciones finales (alto nivel) que se muestran en la Tabla complementaria 3. La concentración de bajo nivel se fijó en cero.

Para la pantalla de factor único de L-aminoácido, cada pocillo contenía solo un aminoácido, y las concentraciones finales fueron el doble que las del ensayo PB (Tabla complementaria 3). La pantalla de factor único de D-aminoácido también se realizó de manera similar, pero usando las concentraciones finales cuando se mezclaron con esporas como se muestra en la Tabla complementaria 3. Para los análogos de D-valina, la concentración final cuando se mezclaron con esporas fue 91.5 mM. La concentración final de purinas cuando se mezclaron con esporas en los cribados de factor único cogerminante fue de 0,1 mM, mientras que los niveles finales de L-cisteína añadidos a cada pocillo cuando se mezclaron con esporas fueron de 10 mM. Para el experimento de germinación a nivel fisiológico, se utilizaron purinas y L-cisteína en concentraciones finales de 0,1 y 1 mM respectivamente.

Se utilizó un diseño factorial completo como se muestra en la Tabla complementaria 2 para estudiar la respuesta de germinación con purinas y para el estudio de interacción de L-aminoácidos. Para el cribado germinativo combinatorio y el cribado cogerminante combinatorio con purinas, se prepararon y diluyeron soluciones madre de 0,6 mM de las respectivas purinas en NaOH 0,005 N (concentración final 0,1 mM) en ausencia y presencia de L-cisteína (concentración final 10 mM) respectivamente con cada pocillo representando una combinación del diseño factorial. Para los estudios de interacción de L-aminoácidos, se usaron L-cisteína y los resultados positivos del examen de PB y factor único y los resultados negativos del examen de PB, respectivamente. Las concentraciones utilizadas fueron las mismas que en la Tabla complementaria 3. Todos los ensayos se configuraron en una placa de microtitulación de 384 pocillos utilizando la estación de trabajo automatizada Biomek i5.

Para los estudios de inhibición de la germinación, se añadieron volúmenes iguales del germinante con el inhibidor enantiomérico de manera que las concentraciones finales de ambos cuando se mezclaron con las esporas fueron de 91,5 mM cada uno. Para los experimentos de respuesta a la dosis, las soluciones madre de germinantes a 100 mM se diluyeron dos veces en serie en agua desionizada hasta una concentración de 90 µM. Las concentraciones finales cuando se mezclaron con esporas oscilaron entre 91,5 mM y 89 µM.

Para el ensayo de liberación de dipicolinato, todos los germinados se prepararon a una concentración de 200 mM y se diluyeron a una concentración final de 100 mM en una mezcla que contenía cloruro de terbio 0,1 mM y oxirasa (1:50 v/v). A 50 µl de esta solución, se añadieron 3,5 µl de esporas de C. novyi-NT en una placa de microtitulación Greiner Bio-One 384 UV star. Las concentraciones finales tras la adición de esporas fueron de 93,5 mM para los germinados y de 0,09 mM para el terbio. La lectura de DO600 y la Fluorescencia a 545 nm (tiempo de retardo de 20 µs) se midieron utilizando un lector de microplacas multimodo Tecan Spark® cada 10 min a través del software Spark Control Dashboard V2.2.

A los medios RCM-FBS que contenían oxirasa (1:50 v/v), se añadieron los correspondientes D-aminoácidos o agua seguido de la adición de esporas de C. novyi-NT en tubos eppendorf de 1,5 ml. Las concentraciones finales de los componentes fueron D-aminoácidos 93,5 mM, 0,35x RCM, 9,3% FBS. Luego, los tubos de cultivo se incubaron durante la noche a 37 °C y luego se tomaron imágenes de alícuotas del cultivo de la noche a la mañana.

Se añadieron alícuotas (10 µl) de experimentos de germinación/crecimiento durante la noche a un portaobjetos de microscopio Superfrost plus, se cubrieron con cubreobjetos de microscopio #1.5 y luego se sellaron con esmalte de uñas. A continuación, se tomaron imágenes de los portaobjetos en un microscopio Zeiss Axio Observer 7 invertido utilizando un objetivo Ph3 Plan APOCHROMAT de 100x/1,4 fijado en un ajuste Optovar de aumento de 1x o 1,6x según se especifica. Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara Hamamatsu CMOS y el software Metamorph (Molecular devices, 7.10.3) con un tiempo de exposición de 100 ms en el modo de contraste de Fase. Las imágenes fueron recortadas usando ImageJ Versión 1.53n.

Los protocolos para la extracción de peptidoglicano fueron adaptados de Atrih et al. (1996,1998) y Popham et al. (1996) para esporas y Atrih et al. (1999) para bacterias vegetativas.

Brevemente, se germinaron 3 ml de esporas de C. novyi-NT (5 × 109 UFC/ml) a 37 °C durante 30 min en una solución germinante que contenía L-cisteína (100 mM), hipoxantina (0,1 mM) y Oxirasa (1 :50 v/v) que al diluirse con las esporas dio una concentración final de L-cisteína (82 mM) e hipoxantina (0,08 mM). Cantidades equivalentes de esporas latentes en PBS 1X y esporas germinadas en agua desionizada se resuspendieron en 1 ml de Propan-2-ol y Propan-1-ol respectivamente y se sometieron a tratamiento térmico a 85 °C durante 15 min. Esto fue seguido por una centrifugación a 14000 × g durante 8 min usando una centrífuga Beckman Coulter Microfuge 22R. Los sedimentos se resuspendieron en 13 ml y 1 ml de tampón Tris 50 mM pH 7,4–4 % SDS–30 mM DTT-2 mM EDTA para muestras de esporas latentes y germinadas, respectivamente. Luego, las muestras se calentaron a 100 °C durante 16 min y luego a 37 °C durante 40 min.

Para el extracto de bacterias vegetativas, se combinaron 3 tubos de cultivo de C. novyi-NT durante la noche (5 ml por tubo) y se resuspendieron en 1 ml de agua desionizada. A continuación, la muestra se calentó a 85 °C durante 15 min y se centrifugó a 14 000 × g durante 8 min. El sedimento se resuspendió en 10 ml de SDS al 5 % y se calentó a 100 °C durante 25 min. La muestra se centrifugó a 14.000 × g durante 8 min y se resuspendió en 1 ml de SDS al 5 % y se calentó de nuevo a 100 °C durante 15 min.

Después de los respectivos tratamientos térmicos, las muestras de bacterias vegetativas y de esporas se centrifugaron a 14000 × g durante 8 min y los gránulos se lavaron cinco veces con agua desionizada precalentada a 37 °C. Se descartó el sobrenadante después del centrifugado final y los sedimentos se trataron con 250 µl de enzima mutanolisina (125 U/ml en tampón de fosfato de sodio 12,5 mM, pH 5,8) durante 16 ha 37 °C. A continuación, las muestras se centrifugaron a 14.000 × g durante 8 min y el sobrenadante se liofilizó durante la noche. A continuación, los gránulos liofilizados se sometieron a hidrólisis en HCl 6 N: ácido trifluoroacético (v/v) 1:1 en un tubo de hidrólisis al vacío Thermofisher (Nº de catálogo 29570) y se calentaron a 160 °C durante 1 h en un baño de aceite. El ácido se evaporó usando un concentrador Eppendorf durante la noche y los gránulos se resuspendieron en 200 µl en agua desionizada y se enviaron para análisis adicionales.

Para el análisis del ácido aminobutírico, se cultivó C. novyi-NT durante la noche en una cámara anaeróbica Plas labs en 5 ml de medio BHI-10%FBS. Se sembraron 100 microlitros del cultivo de la noche a la mañana en una placa de agar BHI-FBS mientras que las placas de control se rayaron con medio BHI-10%FBS. Las colonias se recogieron al día siguiente utilizando 1x PBS (500 µl). Las soluciones se centrifugaron a 5000 rcf, 5 min, 4 °C usando una centrífuga Beckman Coulter Microfuge 22R. El sedimento se resuspendió en acetonitrilo al 50 % y se homogeneizó usando el batidor de bolas Biospec Mini 24 (3500 rotaciones/min, 1 min, 4 veces). A continuación, las muestras se centrifugaron a 16 000 rcf durante 10 min a 4 °C. Los sobrenadantes se liofilizaron y se resuspendieron en acetonitrilo al 10 % y se enviaron para análisis adicionales.

Para los análisis de norvalina y valina, se cultivó C. novyi-NT durante la noche en una cámara anaerobia Plas labs en 5 ml de medio BHI-10%FBS. Los cultivos se centrifugaron a 4700 rcf, 5 min, 4 °C usando una centrífuga Thermo Scientific Sorvall ST 40R, y el sobrenadante se recogió para su posterior análisis. El sedimento se resuspendió en acetonitrilo al 50 % y se homogeneizó usando el batidor de bolas Biospec Mini 24 (3500 rotaciones/min, 1 min, 4 veces). A continuación, las muestras se centrifugaron a 16 000 rcf durante 10 min a 4 °C. Las muestras de control de sobrenadante, gránulos y medios solos se liofilizaron y se resuspendieron en acetonitrilo al 10 % (gránulos) o agua (sobrenadante y medios de control) y se enviaron para análisis adicionales.

Las esporas de C. novyi-NT se germinaron en 91,5 mM (concentración final con esporas) de L-cisteína, L-alanina, L-valina, D-valina y agua que contenía enzima oxirasa (1:50 v/v) durante 30 min a 37 °C. Después de 30 min, las esporas germinadas se sedimentaron a 3900 rcf, 5 min y el sobrenadante de cada muestra se envió para su posterior análisis.

Todos los extractos de peptidoglicano, extractos de metabolitos y muestras de sobrenadante se analizaron con un equipo Agilent 6546 LC/Q-TOF en una columna Phenomenex, Synergi 4 µm Fusion-RP 80 A° con acetonitrilo y formiato de amonio 10 mM/ácido fórmico al 0,1 % móvil. gradiente de fase Las muestras se derivatizaron usando o-ftaldialdehído y N-acetilcisteína en tampón de tetraborato de sodio al 10 %. Los espectros de LC-MS EIC se analizaron utilizando el software MassHunter (Agilent, B.08.00) y Microsoft Excel.

Los experimentos del DOE se replicaron dos veces con dos réplicas técnicas integradas. Se realizaron ensayos de germinación de esporas de un solo factor con 4 réplicas biológicas, excepto en la Fig. 1c, donde se excluyó una réplica biológica para L-asparagina por ser un claro valor atípico. El criterio para la detección de valores atípicos se preestableció como: [xi - mediana (xi)]/(mediana de todas las desviaciones absolutas de la mediana) en un punto de corte de 2,5. Incluir el valor atípico no cambia el resultado del experimento. Se utilizaron más de 3,2 × 108 CFU/ml de esporas para cada experimento de germinación, mientras que para los experimentos de LC-MS se utilizaron esporas del orden de 109 CFU/ml. Esto es muy superior a una cantidad que podría causar errores debido a la falta de muestreo. Los análisis estadísticos para los experimentos combinatorios (ANOVA) se realizaron con el software Minitab 20, mientras que los mismos para los experimentos de factor único (prueba t de Student no pareada) se realizaron con GraphPad Prism v8.4.3 con los valores de p exactos proporcionados en la Tabla complementaria 5 Las medias con desviaciones estándar también se calcularon utilizando GraphPad Prism v8.4.3. Los espectros de LC-MS representativos se determinaron en función de al menos dos muestras independientes para cada condición. Se obtuvieron imágenes representativas basadas en al menos dos muestras independientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementarios). Los datos de origen de las cifras se pueden encontrar en Datos complementarios.

Hatheway, CL Clostridios toxigénicos. clin. Microbiol. Rev. 3, 66–98 (1990).

Artículo CAS Google Académico

Prescott, JF Clostridial Diseases of Animals 13–19 (John Wiley & Sons, Inc, 2016).

McGUIGAN, CC et al. Brote letal de infección por Clostridium novyi tipo A y otros organismos formadores de esporas en consumidores de drogas inyectables escoceses. J.Med. Microbiol. 51, 971–977 (2002).

Artículo Google Académico

Dang, LH, Bettegowda, C., Huso, DL, Kinzler, KW y Vogelstein, B. Terapia bacteriolítica combinada para el tratamiento de tumores experimentales. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 98, 15155–15160 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Cheong, I. et al. Una proteína bacteriana mejora la liberación y la eficacia de los fármacos liposomales contra el cáncer. Ciencia 314, 1308–1311 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Díaz, LA Jr. et al. Evaluación farmacológica y toxicológica de las esporas de C. novyi-NT. Toxicol. ciencia 88, 562–575 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Janku, F. et al. Estudio fase I de inyección intratumoral de esporas de Clostridium novyi-NT en pacientes con tumores sólidos avanzados refractarios al tratamiento. clin. Cáncer Res. Rev. 27, 96–106 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Setlow, P., Wang, S. y Li, Y.-Q. Germinación de esporas de los órdenes Bacillales y Clostridiales. año Rev. Microbiol. 71, 459–477 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Paredes-Sabja, D., Setlow, P. & Sarker, MR Germinación de esporas de especies Bacillales y Clostridiales: mecanismos y proteínas involucradas. Tendencias Microbiol. 19, 85–94 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Swick, MC, Koehler, TM y Driks, A. Sobreviviendo entre anfitriones: esporulación y transmisión. Microbiol. espectro https://doi.org/10.1128/microbiolspec.VMBF-0029-2015 (2016).

Zhu, D., Sorg, JA & Sun, X. Biología de Clostridioides difficile: esporulación, germinación y terapias correspondientes para la infección por C. difficile. Frente. Celúla. Infectar. Microbiol. 8, 29 (2018).

Artículo Google Académico

Hanna, PC & Ireland, JA Entendiendo la patogénesis de Bacillus anthracis. Tendencias Microbiol. 7, 180–182 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Setlow, P. Germinación de esporas de especies de Bacillus: lo que sabemos y lo que no sabemos. J. Bacteriol. 196, 1297–1305 (2014).

Artículo Google Académico

Sinai, L., Rosenberg, A., Smith, Y., Segev, E. y Ben-Yehuda, S. La línea de tiempo molecular de una espora bacteriana revivida. mol. Celda 57, 695–707 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Uchiyama, H., Tanaka, K. & Yanagita, T. Papel de la alanina en la germinación de esporas de Bacillus subtilis. J. Gen. Appl. Microbiol. 11, 233–242 (1965).

Artículo CAS Google Académico

Warren, SC & Gould, GW Germinación de esporas de Bacillus cereus: requisito absoluto para un ácido amínico. bioquimica Biografía. Acta 170, 341–350 (1968).

Artículo CAS Google Académico

Racine, FM, Dills, SS & Vary, JC Germinación de esporas de Bacillus megaterium activada por glucosa. J. Bacteriol. 138, 442–445 (1979).

Artículo CAS Google Académico

Sorg, JA & Sonenshein, AL Sales biliares y glicina como co-minantes de las esporas de Clostridium difficile. J. Bacteriol. 190, 2505–2512 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Paredes-Sabja, D., Torres, JA, Setlow, P. & Sarker, MR Germinación de esporas de Clostridium perfringens: caracterización de los germinantes y sus receptores. J. Bacteriol. 190, 1190–1201 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Winston, JA & Theriot, CM Impacto de los ácidos biliares secundarios derivados de microbios en la resistencia a la colonización contra Clostridium difficile en el tracto gastrointestinal. Anaerobio 41, 44–50 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Weissman, SA & Anderson, NG Diseño de experimentos (DoE) y optimización de procesos. una revisión de publicaciones recientes. org. Resolución de proceso desarrollo 19, 1605-1633 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Sarrafzadeh, MH Requerimientos nutricionales de Bacillus thuringiensis durante diferentes fases de crecimiento, esporulación y germinación evaluados por el método de Plackett-Burman. Irán. J. Chem. Ing. Química 31, 131–136 (2012).

Guizelini, BP, Vandenberghe, LPS, Sella, SRBR & Soccol, CR Estudio de la influencia de las condiciones de esporulación en la resistencia al calor de Geobacillus stearothermophilus utilizado en el desarrollo de indicadores biológicos para esterilización por vapor. Arco. Microbiol. 194, 991–999 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Ryu, Y., Lee, K.-E., Cha, I.-T. & Park, W. Optimización de la esporulación bacteriana utilizando nutrientes económicos para hormigón autorreparable. J. Microbiol. 58, 288–296 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Wasko, A. et al. El diseño de Plackett-Burman en la optimización de componentes de medios para la producción de biomasa de Lactobacillus rhamnosus OXY. Acta Biol. Colgado. 61, 344–355 (2010).

Artículo Google Académico

Huang, J., Ou, Y., Zhang, D., Zhang, G. & Pan, Y. Optimización de la condición de cultivo de Bacillus mucilaginous usando aguas residuales industriales Agaricus bisporus por Plackett-Burman combinado con el método de superficie de respuesta de Box-Behnken. AMB Express 8, 141 (2018).

Artículo Google Académico

Vasiee, A., Behbahani, BA, Yazdi, FT & Moradi, S. Optimización de las condiciones de producción de la lipasa producida por Bacillus cereus a partir de harina de arroz mediante Plackett-Burman Design (PBD) y metodología de superficie de respuesta (RSM). Microbio. Pato. 101, 36–43 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Plackett, RL & Burman, JP El diseño de experimentos multifactoriales óptimos. Biometrika 33, 305–325 (1946).

Artículo Google Académico

Broussolle, V., Gauillard, F., Nguyen-The, C. y Carlin, F. Diversidad de la germinación de esporas en respuesta a la inosina y la L-alanina y su interacción con el NaCl y el pH en el grupo Bacillus cereus. Aplicación J. Microbiol. 105, 1081–1090 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Abel-Santos, E. & Dodatko, T. Reconocimiento diferencial de nucleósidos durante la germinación de esporas de Bacillus cereus 569 (ATCC 10876). Química de Nueva Jersey. 31, 748 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Yasuda, Y. & Tochikubo, K. Iniciación de la germinación y actividades inhibitorias de los análogos de L- y D-alanina para las esporas de Bacillus subtilis. Modificación del grupo metilo de L- y D-alanina. Microbiol. inmunol. 29, 229–241 (1985).

Artículo CAS Google Académico

Mc Kevitt, MT y col. Efectos de la síntesis de alanina endógena y la autoinhibición de la germinación de Bacillus anthracis en infecciones in vitro e in vivo. Inmunidad a la infección 75, 5726–5734 (2007).

Artículo Google Académico

Fey, BYG, Gould, GW & Hitchins, AD Identificación de D-alanina como autoinhibidor de la germinación de esporas de BaciZZus gZobigii. J. Gen. Microbiol. 35, 229–236 (1964).

Artículo CAS Google Académico

Horcajo, P., de Pedro, MA & Cava, F. Plasticidad de peptidoglicanos en bacterias: edición de peptidoglicanos inducida por estrés por D-aminoácidos no canónicos. Microbio. Resistencia a las drogas. 18, 306–313 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Lam, H. et al. Los D-aminoácidos gobiernan la remodelación de la pared celular en fase estacionaria en bacterias. Ciencia 325, 1552-1555 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Takumi, K. & Kawata, T. Análisis químicos cuantitativos y propiedades antigénicas de peptidoglicanos de Clostridium botulinum y otros clostridios. Jpn. J. Microbiol. 20, 287–292 (1976).

Artículo CAS Google Académico

Takumi, K. & Kawata, T. Composición química de las paredes celulares de Clostridium botulinum tipo A. Jpn. J. Microbiol. 14, 57–63 (1970).

Artículo CAS Google Académico

Hiraoka, N. et al. Los perfiles de aminoácidos tisulares son característicos del tipo de tumor, el fenotipo maligno y la progresión tumoral en los tumores pancreáticos. ciencia Rep. 9, 9816 (2019).

Artículo Google Académico

Elsden, SR & Hilton, MG Patrones de utilización de aminoácidos en la taxonomía clostridial. Arco. Microbiol. 123, 137–141 (1979).

Artículo CAS Google Académico

Mead, GC Los clostridios fermentadores de aminoácidos. J. Gen. Microbiol. 67, 47–56 (1971).

Artículo CAS Google Académico

Betegowda, C. et al. El genoma y los transcriptomas del agente antitumoral Clostridium novyi-NT. Nat. Biotecnología. 24, 1573–1580 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Ross, C. & Abel-Santos, E. La familia de receptores Ger de bacterias esporulantes. actual Cuestiones Mol. Biol. 12, 147–158 (2010).

CAS Google Académico

Shrestha, R., Cochran, AM & Sorg, JA El requisito de cogerminantes durante la germinación de esporas de Clostridium difficile está influenciado por mutaciones en yabG y cspA. Patog de PLoS. 15, e1007681 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Bhattacharjee, D. & Sorg, JA Conservación de la ruta de germinación 'de afuera hacia adentro' en Paraclostridium bifermentans. Frente. Microbiol. 9, 2487 (2018).

Artículo Google Académico

Bhattacharjee, D., McAllister, KN & Sorg, JA Germinantes y sus receptores en clostridios. J. Bacteriol. Rev. 198, 2767–2775 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Adam, KH, Brunt, J., Brightwell, G., Flint, SH & Peck, MW Germinación de esporas del psicrotolerante, saboteador de carne roja, Clostridium frigidicarnis: Cl. Germinación de esporas de frigidicarnis. Letón. aplicación Microbiol. 53, 92–97 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Howerton, A., Ramirez, N. & Abel-Santos, E. Mapeo de interacciones entre germinantes y esporas de Clostridium difficile. J. Bacteriol. 193, 274–282 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Waites, WM & Wyatt, LR Germinación de esporas de Clostridium bifermentans por ciertos aminoácidos, lactato y piruvato en presencia de iones de sodio o potasio. J. Gen. Microbiol. 67, 215–222 (1971).

Artículo CAS Google Académico

Waites, WM & Wyatt, LR El efecto del pH, los germinantes y la temperatura en la germinación de esporas de Clostridium bifermentans. J. Gen. Microbiol. 80, 253–258 (1974).

Artículo CAS Google Académico

Shrestha, R. & Sorg, JA Reconocimiento jerárquico de cogerminantes de aminoácidos durante la germinación de esporas de Clostridioides difficile. Anaerobio 49, 41–47 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Brunt, J. et al. La caracterización funcional de los receptores germinativos en Clostridium botulinum y Clostridium sporogenes presenta nuevos conocimientos sobre los sistemas de germinación de esporas. Patog de PLoS. 10, e1004382 (2014).

Artículo Google Académico

Watabe, K., Nishihara, T. & Kondo, M. Estudios bioquímicos sobre la germinación de esporas bacterianas. II. El mecanismo inhibidor de D-alanina en la germinación inducida por L-alanina de Bacillus thiaminolyticus. Jpn. J. Microbiol. 18, 181–184 (1974).

Artículo CAS Google Académico

Shrestha, R., Lockless, SW & Sorg, JA Una alanina racemasa de Clostridium difficile afecta la germinación de esporas y acomoda la serina como sustrato. J. Biol. química 292, 10735–10742 (2017).

Artículo CAS Google Académico

McKeown, SR Definición de normoxia, fisioxia e hipoxia en tumores: implicaciones para la respuesta al tratamiento. Hermano J. Radiol. 87, 20130676 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Betegowda, C. et al. Superando la barrera hipóxica a la radioterapia con bacterias anaerobias. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 100, 15083–15088 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Vukovic, V. & Nicklee, T. Heterogeneidad microrregional de tioles no proteicos en carcinomas cervicales evaluados mediante el uso combinado de HPLC y análisis de imágenes de fluorescencia1. clin. Cáncer Res. 6, 1826–1832 (2000).

CAS Google Académico

Lin, J. et al. Homocisteína y cisteína plasmáticas y riesgo de cáncer de mama en mujeres. Cáncer Res. 70, 2397–2405 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Koch, CJ & Evans, SM Concentraciones de cisteína en tumores de roedores: valores inesperadamente altos pueden causar resistencia a la terapia. En t. J. Cáncer 67, 661–667 (1996).

3.0.CO;2-8" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0215%2819960904%2967%3A5%3C661%3A%3AAID-IJC12%3E3.0.CO%3B2-8" aria-label="Article reference 58" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0215(19960904)67:53.0.CO;2-8">Artículo CAS Google Académico

Nunes, SC et al. La cisteína permite que las células de cáncer de ovario se adapten a la hipoxia y escapen de la citotoxicidad del carboplatino. ciencia Rep. 8, 9513 (2018).

Artículo Google Académico

Yin, J. et al. Mecanismos potenciales que conectan el metabolismo de las purinas y la terapia contra el cáncer. Frente. inmunol. 9, 1697 (2018).

Artículo Google Académico

Sullivan, MR et al. La cuantificación de metabolitos microambientales en cánceres murinos revela determinantes de la disponibilidad de nutrientes tumorales. Elife 8, e44235 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Luu, H., Akoachere, M., Patra, M. & Abel-Santos, E. Cooperatividad e interferencia de las vías de germinación en las esporas de Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 193, 4192–4198 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Ando, ​​Y. Los requisitos de germinación de las esporas de Clostridium botulinum tipo E. Jpn. J. Microbiol. 15, 515–525 (1971).

Artículo CAS Google Académico

Roberts, Nueva Jersey y col. La inyección intratumoral de esporas de Clostridium novyi-NT induce respuestas antitumorales. ciencia Traducir Medicina. 6, 249ra111 (2014).

Artículo Google Académico

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Nos gustaría agradecer al Dr. Steven Yuan del laboratorio CMMAC, Universidad Nacional de Singapur por el análisis LC-MS. Este trabajo fue apoyado por Temasek Life Sciences Laboratory Core Funding (http://www.tll.org.sg) (a IC). El financiador no participó en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Estos autores contribuyeron por igual: Mai Le Ngoc, Marvell Ung Wew, Varsha Ramkumar.

Laboratorio de Ciencias de la Vida Temasek, Singapur, Singapur

Ajitha Sundaresan, Prahlad Raninga, Rongji Sum e Ian Cheong

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, Singapur

Ajitha Sundaresan, Rongji Sum e Ian Cheong

NUS High School of Mathematics and Sciences, Singapur, Singapur

Mai Le Ngoc, Marvell Ung Wew y Varsha Ramkumar

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Conceptualización (AS e IC). Curación de datos (AS, LNM, MWU, VR e IC). Análisis formal (AS, LNM, MWU, VR e IC). Adquisición de fondos (IC). Investigación (AS, LNM, MWU, VR, PR y RS). Metodología (AS e IC). Administración de proyectos (AS). Software (CI). Supervisión (AS e IC). Validación (AS). Visualización (AS e IC). Redacción – borrador original (AS e IC). Redacción: revisión y edición (AS, LNM, MWU, VR, PR, RS e IC).

Correspondencia a Ian Cheong.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Yuting Ma y Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Sundaresan, A., Le Ngoc, M., Wew, MU et al. Una pantalla de diseño de experimentos revela que la detección de germinación de esporas de Clostridium novyi-NT es estereoflexible para la valina y sus análogos. Comun Biol 6, 118 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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Recibido: 07 junio 2022

Aceptado: 17 de enero de 2023

Publicado: 28 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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