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May 21, 2023

Daño anatómico causado por Bacillus thuringiensis variedad israelensis en larvas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti (L.) revelado por micro

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8759 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Con técnicas de microtomografía computarizada, utilizando el contraste de fase del algoritmo de recuperación de fase de distancia única, reconstruimos imágenes renderizadas mejoradas de tejidos blandos de larvas de cuarto estadio de Aedes aeqypti después del tratamiento con Bti. A diferencia de publicaciones anteriores basadas en microscopía convencional, ya sea óptica o electrónica, que se limitaban a estudios parciales, en su mayoría en forma de cortes histológicos, aquí mostramos por primera vez los efectos de Bti en la anatomía interna completa de un insecto. . Utilizando imágenes renderizadas en 3D, fue posible estudiar el efecto de la bacteria en tejidos y órganos, no solo en secciones sino también en su conjunto. Comparamos la anatomía de larvas sanas con los cambios que experimentan las larvas tras ser expuestas a Bti (durante 30 min, 1 hy 6 h) y observamos el daño progresivo que produce Bti. Se constató daño en el epitelio del intestino medio, con edema progresivo de los enterocitos, engrosamiento del epitelio, aumento de los espacios vacuolares y finalmente lisis celular, produciendo aperturas en las paredes del intestino medio. Simultáneamente, las larvas alteraron su motilidad, lo que les dificultó subir a la superficie y colocar el sifón respiratorio adecuadamente para romper la tensión superficial y respirar. Internamente se observaron fenómenos de choque osmótico, resultando en una deformación de la forma de la sección transversal, produciendo la aparición de un amplio espacio interno entre la cutícula y las estructuras internas y un colapso progresivo de los troncos traqueales. En conjunto, estos resultados indican la muerte de las larvas, no por inanición como consecuencia de la destrucción de los epitelios del tubo digestivo como se ha señalado anteriormente, sino por un proceso sinérgico catastrófico multifactorial además de asfixia por falta de una adecuada el intercambio de gases.

Bacillus thuringiensis (Bt) fue descubierto por primera vez en 1901 por Shigetane Ishiwata, quien aisló una bacteria de larvas de gusanos de seda muertas mientras investigaba la causa de la llamada "enfermedad de sotto" (enfermedad de colapso repentino). Llamó a la bacteria Bacillus sotto1. Varios años más tarde, Ernst Berliner aisló una cepa relacionada a partir de larvas de polilla de la harina del Mediterráneo muertas encontradas en un molino de harina en Turingia y, a partir de entonces, denominó apropiadamente a la bacteria B. thuringiensis. Este autor también observó que una solución de toxinas Bt cristalizadas era altamente efectiva contra ciertas plagas de cultivos2,3,4.

Bt es una bacteria Gram-positiva formadora de esporas que se encuentra en todo el mundo y en todos los ecosistemas probados5. Durante la esporulación, las cepas de Bt sintetizan toxinas proteicas cristalinas (Cry) y citolíticas (Cyt) llamadas δ-endotoxinas como cuerpos paraesporales, que son tóxicos para muchos insectos6,7. Se ha demostrado que cuando las larvas de insectos ingieren estos cristales de proteína, estos son solubilizados por el ambiente alcalino del intestino medio y las protoxinas son activadas por las enzimas digestivas provocando poros en la membrana celular del tubo digestivo, con consecuencias letales para los insectos, es decir : Refs.8,9.

La primera producción comercial de Bt como insecticida se informó en 1938 en Francia y se vendió con el nombre de "Sporéine", y desde entonces su uso en el desarrollo de productos avanzados ha ido en continuo aumento10. Angus, utilizando larvas de gusanos de seda (Bombyx mori) y una cepa de la subespecie Bt sotto, fue el primero en probar que la toxina Cry era el principal agente insecticida11, y luego se demostró que el epitelio intestinal era el sitio de acción de la δ -endotoxinas12. Hoy en día, las proteínas Cry han sido probadas para atacar diversas especies de diferentes órdenes de insectos y algunos otros invertebrados como ácaros y nematodos13. Aunque existe una controversia de larga data sobre si existen riesgos de efectos a largo plazo en los ecosistemas por la liberación indiscriminada de Bt en la naturaleza14,15,16, los productos Bt se consideran una alternativa mucho mejor que los insecticidas químicos dada su especificidad y biodegradabilidad. .

Desde el aislamiento de la variedad Bt israelensis (Bti), cuyas parasporas tienen una fuerte acción patógena sobre las larvas de mosquitos14,15 (además de las larvas de mosca negra y quironómidos), su uso para el control de mosquitos y el número de publicaciones se ha incrementado exponencialmente16 .

Si bien existen numerosos estudios sobre los mecanismos que permiten su acción biocida, pocos estudios han demostrado daño anatomohistológico17. Sin embargo, se ha informado la histopatología del intestino medio y la patogenia de las toxinas Bti para varias especies de larvas de mosquitos Culicidae18,19,20,21,22,23,24,25,26, incluido el mosquito de la fiebre amarilla19,20,21,27,28 .

Para evaluar el daño causado por Bti, es importante poder comparar con la anatomía de larvas sanas. Existen varios estudios sobre este tema, comenzando por el clásico estudio sobre anatomía de mosquitos de Snodgrass29 y la extraordinaria compilación de Christophers30, y un estudio reciente con una caracterización histológica del intestino medio de larvas sanas de A. aegypti31.

Tras el aislamiento15 y caracterización de una cepa de Bt cuyas inclusiones paraesporales tenían fuerte poder patógeno para larvas de Culicidae14, se iniciaron estudios citológicos sobre los efectos histopatológicos de Bti en A. aegypti18,19. El trabajo pionero de Charles, primero con microscopía óptica19 y luego con microscopía electrónica de transmisión20, fue el primero en demostrar el daño causado por Bti a nivel tisular, principalmente en el tracto digestivo.

A diferencia de publicaciones anteriores, basadas en microscopía convencional, ya sea óptica o electrónica, que se limitaban a estudios parciales mayoritariamente en forma de cortes histológicos, en este trabajo, y gracias al micro-CT, se ha podido mostrar el interior anatomía de un insecto tratado con Bt en su totalidad por primera vez. Mediante imágenes renderizadas en 3D fue posible estudiar no solo las estructuras en secciones sino también en su conjunto, y comparando la anatomía de larvas sanas y los cambios sufridos después de ser expuestas a Bti durante 30 min, 1 h y 6 h, la progresiva Se ha descrito el daño que produce el Bti.

La cepa bacteriana utilizada en este trabajo fue B. thuringiensis var. israelensis 4Q5 (Bti 4Q5), del Bacillus Genetic Stock Center de la Universidad Estatal de Ohio. Bti 4Q5 se cultivó en 50 ml de medio T332 a 30 °C y en condiciones aeróbicas (200 rpm) durante 72 h hasta observar una esporulación completa (107 esporas/ml). El cultivo se centrifugó a 4000 g durante 20 min y el sedimento se lavó tres veces y se resuspendió en 5 ml de agua Milli-Q (22 mg de suspensión de cristales de esporas/ml). La suspensión de esporas y cristales obtenida se mantuvo a 4 °C hasta su uso.

Después de la llegada, los huevos se colocaron en un recipiente de vidrio con agua del grifo sin cloro y comida seca comercial para gatos molida. El recipiente se incubó en una sala de insectos (25 °C ± 2 °C, 65% de humedad y un fotoperíodo de 16 h:8 h luz:oscuridad). En estas condiciones, los huevos eclosionaron en dos días. Se suministró comida para gatos cuando fue necesario. Para el bioensayo con Bti 4Q5 se usaron larvas del cuarto estadio temprano de Aedes aegypti. Las larvas restantes, que no se usaron en el bioensayo, se mataron agregando lejía al contenedor de crianza.

Diez larvas de A. aegypti se colocaron en un tubo de plástico de 30 ml que contenía 10 ml de agua del grifo sin cloro y comida seca para gatos y se mantuvieron en la sala de insectos en las mismas condiciones descritas anteriormente. Se añadieron a las larvas cien microlitros de la suspensión de esporas y cristales de Bti 4Q5 descrita anteriormente. Se extrajeron dos larvas a diferentes tiempos (30 min, 1 hy 6 h) con el uso de una pipeta Pasteur de plástico y se colocaron en tubos de plástico con 5 ml de etanol al 70%. Después del transcurso del tiempo, las larvas se fijaron y se trataron para microtomografía como se describe a continuación. Las larvas de 30 min estaban vivas, y las larvas retiradas 1 hy 6 h después del inicio del bioensayo estaban muertas.

Para el estudio microtomográfico, de cada bioensayo se tomaron dos larvas ya conservadas en etanol al 70% con tiempos crecientes de exposición al Bti, y se deshidrataron con concentraciones crecientes de etanol (80%, 90%, 100%) durante 30 min cada una a temperatura ambiente. Antes de escanear, las larvas se tiñeron en una solución de yodo al 1 % en etanol absoluto al 100 % durante 24 h, se sumergieron en hexametildisilazano (HMDS) durante 12 h y se secaron al aire durante la noche. Las muestras se escanearon en un tubo Eppendorf de 0,2 ml (que se adjuntó al portamuestras con plastilina, y las larvas se fijaron en el interior con Basotect® [espuma de resina de melamina, creada por la empresa química BASF], un material fácil de eliminar digitalmente33 [Fig. 1a]) o pegado con cianoacrilato a la punta de un hilo de pescar de nylon (200 µm de diámetro) y cubierto con una pajita de plástico para evitar cualquier movimiento inducido por la corriente de refrigeración del aire durante el proceso de escaneo (Fig. 1b). Se utilizó un microtomógrafo de escritorio de alta resolución SkyScan 1172, actualizado para tener una fuente Hamamatsu L702 (100/250) y una cámara Ximea 11Mp. Los parámetros de escaneo se configuraron de la siguiente manera: tamaño de vóxel isotrópico = 0,54 µm; Tensión de fuente = 48 kV, corriente de fuente = 49 μA, paso de rotación de imagen = 0,53° (0,2 para las larvas de 6 h), barrido de rotación de 180° y sin filtro. Para poder capturar toda la longitud de las larvas, fue necesario realizar 5–7 escaneos de gran tamaño conectados. Las imágenes Tiff resultantes se reconstruyeron con el reciente software NRecon de Bruker micro-CT (v.2.0.0.5) utilizando el algoritmo de recuperación de fase de distancia única descrito por David Paganin et al.34, que permite imágenes mejoradas reconstruidas con contraste de fase de tejidos blandos. .

Imágenes renderizadas en 3D por Micro-CT con secciones sagitales de larvas de A. aegypti en el cuarto estadio. Muestras montadas listas para escanear (a,b) y larvas conservadas en etanol (c–e). Deformación (d) después de la exposición a B. thurigiensis var. israelensis (Bti) y espacio vacío creado, marcado con flechas rojas (e). Control de larva sana (c,f,g). Larvas tras diferentes tiempos de exposición a Bti (d,e,h–k): 30 min (d,e,h), 1 h (i,j), 6 h (k). Detalles del epitelio del intestino medio anterior y los músculos circundantes (g, i). Nótese la deformación (d) y el espacio vacío creado (e), y el efecto de lisis celular progresiva causada por Bti, que se observa en forma de aberturas en el epitelio del intestino medio. Los segmentos abdominales están numerados. Fd comida, Fme epitelio anterior del intestino medio, Gc ciego gástrico, músculos Mu, aberturas del epitelio del intestino medio Op, membrana peritrófica Pm.

El software Skyscan de Bruker micro-CT CTAnalyser v.1.20.8.0 se utilizó para el proceso de "limpieza" principal. Las imágenes resultantes se reorientaron con DataViewer v.1.6.0.0 (usado para obtener imágenes renderizadas en cortes de las Figs. 3 y 4), y se usó CTvox v.3.3.1 para obtener imágenes renderizadas en 3D de las Figs. 1f–k y 2 y el video complementario S1, como se describió anteriormente35.

Imágenes renderizadas en 3D por Micro-CT con secciones sagitales de larvas de A. aegypti en el cuarto estadio que muestran la anatomía interna para visualizar la superficie externa del epitelio del tracto digestivo. Controle la larva sana (a) y la larva después de 1 h de exposición a Bti (b). Nótese en b el daño causado por el Bti, que se puede ver en forma de aberturas y espacios vacíos creados.

Las imágenes de micro-CT renderizadas de larvas muestran las principales estructuras y órganos anatómicos (Figs. 1f-k y 2 y Video complementario S1). Así, además de las estructuras externas de la cabeza, tórax y abdomen, se muestran en detalle los detalles anatómicos internos, con el cerebro, los músculos, los cuerpos grasos y el tubo digestivo (abertura bucal, faringe, esófago, proventrículo, gástrico ciego, intestino medio, recto y la posición de la abertura anal). En el interior del tracto digestivo, se puede ver la membrana peritrófica circundante y la capa epitelial. Además, las glándulas salivales, los túbulos de Malpighi (Figs. 1f,h,j; 2, 3 y 4) y los discos imaginales de las piernas (Figs. 2b, 3c) son claramente visibles.

Cortes de micro-CT generaron imágenes con secciones sagitales de larvas de A. aegypti en cuarto estadio, comparables a las obtenidas en la literatura utilizando técnicas de microscopía histológica, que muestran la anatomía interna. Control de larva sana (a). Larvas tras diferentes tiempos de exposición a Bti (b–d): 30 min (b), 1 h (c) y 6 h (d). Obsérvese el espacio vacío creado y el efecto de lisis celular causado por Bti, que se observa en forma de aberturas en el epitelio del intestino medio, un aumento de vacuolas y una hinchazón progresiva del epitelio celular del intestino medio, que se observa como un aumento del grosor. Fd comida, Fme epitelio anterior del intestino medio, Gc ciego gástrico, músculos Mu, aberturas del epitelio del intestino medio Op, membrana peritrófica Pm, vacuolas Vc.

Imágenes renderizadas en cortes de micro-CT con secciones transversales de larvas de A. aegypti en cuarto estadio al nivel del tercer (a,c,e) y quinto segmento abdominal (b,d,f,g). Control de larva sana (a, b). Larvas tras diferentes tiempos de exposición a Bti (c–g): 30 min (c,d), 1 h (e,f) y 6 h (g). Obsérvese el espacio vacío creado y el efecto de lisis celular causado por Bti, que se observa en forma de aberturas en el epitelio del intestino medio, un aumento de las vacuolas, una hinchazón progresiva del epitelio celular del intestino medio (observado como un aumento del grosor) y una progresiva colapso de los troncos traqueales.

Después de la exposición a Bti, las larvas se volvieron menos activas y se comportaron de manera errática, con movimientos cada vez más lentos, menos viajes a la superficie para tomar oxígeno y finalmente la muerte. Durante este proceso, las larvas se vuelven progresivamente más blandas y flácidas. Cuando se compara con las larvas de control (Figs. 1c,f, 2a, 3a, 4a,b), según el tiempo de exposición a Bti, se produce una deformación progresiva y se observan espacios vacíos conspicuos entre la cutícula y las estructuras internas. Estos cambios son visibles bajo un microscopio binocular estereoscópico (Fig. 1d, e) y se muestran claramente en imágenes micro-CT renderizadas (Figs. 1h, j, 2b, 3b, c, 4c-f). Además, cuando se ve en sección transversal, está claro que en comparación con las larvas no tratadas, que tienen una parte ventral plana (Fig. 4a,b), después de la exposición a Bti, la sección se vuelve casi circular (Fig. 4e,f) . Paralelamente, cuando se compara con las larvas de control (Figs. 1c,f,g, 2a, 3a, 4a,b), el efecto de lisis celular progresiva causado por Bti se observa como un aumento en las vacuolas y una inflamación progresiva del epitelio celular del intestino medio. , en el que se puede observar un aumento de grosor junto con amplias aberturas en las paredes del intestino medio (Fig. 1i-k). Estas aberturas se pueden observar en las imágenes renderizadas en 3D, en las que la superficie externa del epitelio del intestino medio se ha reconstruido como hendiduras transversales del intestino medio muy visibles (Fig. 2b), así como en las secciones transversales de las imágenes renderizadas (Figs. 3c, d, 4c-g). Además de estas aberturas, se ven vacuolas en las células epiteliales del intestino medio (Figs. 3d, 4f, g). Además, los troncos traqueales dorsales colapsan progresivamente desde una sección oblonga regular (Fig. 4a,b), reduciendo sus luces (Fig. 4e,f), hasta que se vuelven casi indistinguibles (Fig. 4g). Después de 6 h de exposición a Bti, la degradación fue máxima y las larvas mostraron paredes epiteliales del intestino medio altamente degradadas, un aumento del volumen celular con vacuolas y aberturas y troncos traqueales totalmente colapsados ​​(Figs. 1k, 3d, 4e-g).

El efecto de Bti en el movimiento larval observado aquí se informó previamente en Aedes albopictus26 y A. aegypti36.

Las imágenes 3D renderizadas por micro-CT que se muestran en este trabajo son comparables a las obtenidas con métodos anatómicos clásicos33. Así, las imágenes renderizadas en 3D que obtuvimos de A. aegypti permiten identificar estructuras anatómicas y órganos previamente descritos para mosquitos Culicidae en trabajos clásicos como los de Snodgrass29 o Christophers30 así como en otros más recientes19,20,21,26,31, 37,38,39. Incluso las imágenes histológicas que se muestran en esos artículos anteriores son comparables a las imágenes renderizadas por micro-CT que se muestran en las Figs. 3 y 4. Además, la calidad de las imágenes renderizadas de micro-CT obtenidas es muy superior a las obtenidas mediante técnicas de Tomografía de Coherencia Óptica, utilizadas recientemente para estudiar mosquitos40. Anteriormente usamos Micro-CT para describir la anatomía de diferentes insectos33,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57, pero esto es la primera vez, que sepamos, que esta tecnología se utiliza para estudiar los efectos de un patógeno en su huésped.

Una degradación similar del epitelio del intestino medio observada en este trabajo ha sido ampliamente reportada en otros dípteros, particularmente en mosquitos Culicidae, después de la exposición a toxinas Bti18,19,20,22,23,24,25,26,28,37,39. De hecho, la primera evidencia histológica de daño histopatológico causado por Bti en A. aegypti fue publicada por Charles & Barjac19,20, quienes determinaron y describieron cómo ante los primeros signos, la evolución más rápida se da en el intestino medio. Observaron que estaba completamente lisado 25 min después de la adición de la toxina, mientras que las células en las áreas posteriores estaban mucho menos alteradas en esta etapa. Las células del proventrículo no parecían sufrir ningún cambio y la membrana peritrófica continuaba siendo secretada sin cambios observables. Lüthy & Wolfersberger28 reportaron que los cambios histopatológicos intracelulares ocurren muy rápido, en un lapso de tiempo de cinco a diez minutos. Estos son totalmente consistentes con nuestras observaciones ya que 30 min después de la exposición a Bti observamos la lisis de las paredes epiteliales del intestino medio, claramente visibles como aberturas conspicuas. Además, Clark37 describió que tras la exposición a Bti las células epiteliales presentan un aspecto degradado con extracción citoplasmática, aumento del volumen celular, vesículas secretoras y vacuolas. En resumen, el daño consistió en agujeros y ampollas en la membrana, con separación de células, lo cual es totalmente consistente con lo que observamos por micro-CT después de la exposición progresiva a Bti.

Tanto las familias de proteínas Cry como Cyt producidas por Bt tienen actividad contra insectos de diferentes órdenes alterando las membranas. Específicamente, las toxinas Cyt interactúan directamente con los lípidos de la membrana6, lo que afecta la permeabilidad de la membrana en las líneas celulares de insectos, mientras que las toxinas Cry matan las células al formar poros después del reconocimiento y la unión del receptor, lo que lleva a la muerte celular por lisis osmótica coloidal28,58. En nuestro estudio observamos el efecto combinado de ambos tipos de toxinas, ya que Bti 4Q5 produce tres toxinas Cry (Cry4Aa, Cry4Ba y Cry11Aa) y una proteína Cyt (Cyt1Aa), con posible producción de Cyt2Ba, Cry1Ca y Cry10Aa59.

Desde un punto de vista macroscópico, después de la exposición a Bti, las alteraciones en el intestino medio dan como resultado un choque osmótico y una acumulación de agua en el cuerpo de la larva, creando un espacio vacío entre la cutícula y las estructuras internas, y la deformación observada del abdomen que se vuelve aproximadamente circular. en la sección.

Independientemente de los mecanismos que se han postulado en los últimos años como diferentes modelos de lisis y muerte celular, en la actualidad se considera que el daño ocasionado por la degradación de las paredes epiteliales del tubo digestivo es el principal motivo de muerte de las larvas. Así, tradicionalmente se ha considerado que esta destrucción del intestino conduce al rápido cese de la alimentación y posterior muerte del insecto por inanición59. Sin embargo, al menos en Ae. En el caso de Agypti, el mal funcionamiento intestinal y la inanición no podían producir la muerte en tan poco tiempo. Además, la membrana intestinal se destruye a medida que la liberación de jugos gástricos alcalinos en la hemolinfa cambia el pH y la alcaliniza. En los insectos, se ha demostrado que estos cambios afectan el funcionamiento del sistema nervioso, llegando incluso a producir parálisis60. Esto es congruente con nuestras observaciones. Así, el colapso de las células y el consiguiente daño de los órganos, las alteraciones del sistema nervioso que afectan los movimientos y en casos extremos la parálisis, ciertamente comprometen los movimientos normales de las larvas hacia la superficie del agua y el posicionamiento adecuado del sifón de respiración para el intercambio de gases. Además, el colapso de los troncos traqueales, observado por primera vez en este estudio, ciertamente implicaría la muerte debido a una sinergia de factores, incluida la dificultad para realizar correctamente el intercambio gaseoso.

El uso de la técnica de micro-CT nos permitió realizar una reconstrucción completa de la anatomía de larvas de cuarto estadio de la especie de mosquito de la fiebre amarilla A. aegypti, ubicando la posición real de estructuras y órganos internos y comparando estructuras anatómicas internas de larvas sanas con otros después de diferentes tiempos de exposición a Bti y comparando la evidencia de los daños. También incluimos imágenes renderizadas micro-CT 3D detalladas y video complementario S1. Este trabajo representa la primera reconstrucción completa en micro-CT de la anatomía interna de larvas de cuarto estadio de A. aegypti, mostrando los daños causados ​​por la acción de Bti, como el engrosamiento de las células epiteliales del intestino medio (enterocitos), la apariencia de vesículas (vacuolas) y la separación de las células generando las aberturas (agujeros y hendiduras) que aparecen en el intestino medio minutos después de la exposición a Bti. Estos hallazgos fueron consistentes con los fenómenos primero descritos e ilustrados por medio de secciones histológicas observadas en diapositivas. Sin embargo, el micro-CT nos ha permitido obtener imágenes renderizadas de alta calidad de detalles de las larvas, algunas de las cuales son equivalentes a las obtenidas previamente por microscopía óptica, pero pudimos ver los animales completos en lugar de parte de las larvas, con unas características totalmente nuevas. perspectivas de las estructuras 3D dentro de los especímenes completos.

La lisis celular altera diferentes tejidos y órganos, con probables cambios en el pH de la hemolinfa por la liberación de jugos gástricos del intestino. Esto afectaría al normal funcionamiento del sistema nervioso, produciéndose el ya conocido efecto sobre la motilidad de las larvas. Dificultaría que las larvas lleguen a la superficie del agua y coloquen el sifón respiratorio de forma correcta para romper la tensión superficial del agua. Estos factores, junto con el hecho de que la micro-CT ha demostrado que Bti produce un choque osmótico, creando un extenso espacio vacío y un colapso de los troncos traqueales dorsales, ciertamente explicarían la muerte de las larvas, no por inanición como se dijo anteriormente, sino por debido a procesos multifactoriales catastróficos sinérgicos. Además, se produciría asfixia por falta de un adecuado intercambio gaseoso. El enfoque utilizado y los resultados obtenidos aquí abren nuevas perspectivas para futuras investigaciones y demuestran que Micro-CT representa una metodología sólida, no solo para estudiar la anatomía de los insectos, sino también para estudiar el efecto patogénico de los entomopatógenos hacia los insectos.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el transcurso del estudio están disponibles en JA-T. previa solicitud razonable.

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This paper benefited from funding from the Consejería de Universidad, Investigación e Innovación of Junta de Andalucia (Spain) and FEDER Programe through the research projects: "Caracterización de variantes de toxinas Cry activas frente a la Mosca de la Fruta del Mediterráneo (Ceratitis capitata) obtenidas mediante la tecnología del despliegue de proteínas en fagos" (B-BIO-081-UGR18) and "Búsqueda de nuevas toxinas Cry con actividad frente al ectoparásito de la abeja Varroa destructor mediante la evolución in vitro de proteínas y la técnica del despliegue de proteínas en fago" (A-BIO-424-UGR20), led by Dr. Susana Vilchez. We thank the staff of Bruker SkyScan in Kontich (Belgium) for their effectiveness and fast support, for their constant improvements to the software and for implementing the new options we requested. In this respect, we are especially indebted to Alexander Sasov (now at NeoScan www.neoscan.com), Stephan Boons, Xuan Liu, Phil Salmon and Vladimir Kharitonov. We are grateful to Dr. Colin Berry from the University of Cardiff for providing A. aegypti eggs and the Bti 4Q5 strain.

Departamento de Zoología, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, 18071, Granada, España

Javier Alba-Tercedor

Instituto de Biotecnología y Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, 18071, Granada, España

Susana Vilchez

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Concibió y diseñó los experimentos: SV Realizó los experimentos de exposición Bti: SV. Preparación de muestras, escaneo de micro-CT, tratamiento de software para obtener imágenes renderizadas, placas de figuras y preparación de video complementario: JA-T. Análisis e interpretación de resultados: JA-T., SV Redacción del artículo: JA-T., SV

Correspondence to Javier Alba-Tercedor or Susana Vilchez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Alba-Tercedor, J., Vilchez, S. Daño anatómico causado por Bacillus thuringiensis variedad israelensis en larvas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti (L.) revelado por microtomografía computarizada. Informe científico 13, 8759 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35411-1

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Recibido: 13 enero 2023

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 30 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35411-1

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