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May 31, 2023

Desarrollo del bucle ambiental

Parásitos y vectores

Parásitos y vectores volumen 16, Número de artículo: 78 (2023) Citar este artículo

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Los cambios globales están modificando la distribución de las enfermedades transmitidas por vectores al propagar los vectores a áreas que anteriormente no eran endémicas. Desde 2013, la esquistosomiasis urogenital ha surgido en Córcega y amenaza a los países europeos. Los vectores gasterópodos liberan larvas de esquistosomas que pueden infectar a los humanos que entran en contacto con cuerpos de agua dulce. El monitoreo de los vectores huéspedes de la esquistosomiasis es un requisito previo para comprender y, posteriormente, controlar la transmisión de este patógeno. Debido a que las encuestas malacológicas consumen mucho tiempo y requieren experiencia especial, es deseable el uso de un método molecular simple.

El objetivo de este estudio es desarrollar un protocolo listo para usar utilizando el método LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle) para detectar ADN ambiental de Bulinus truncatus, vector de Schistosoma haematobium. Curiosamente, el método LAMP posee todas las características requeridas para la adaptabilidad a las condiciones de campo, particularmente en países de bajos ingresos: velocidad, simplicidad, reactivos liofilizados, bajo costo y robustez contra los inhibidores de la amplificación del ADN. Hemos probado este nuevo método en muestras de agua de Córcega previamente analizadas por qPCR y ddPCR.

Demostramos que nuestra herramienta de diagnóstico B. truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) puede detectar el eDNA de Bulinus truncatus con la misma eficacia que los otros dos métodos. Bt-eLAMP puede incluso detectar 1/4 de las muestras positivas no detectables por qPCR. Además, el protocolo completo Bt-eLAMP (muestreo, preprocesamiento de muestra, amplificación y revelación) no requiere equipos sofisticados y se puede realizar en 1 ½ h.

La detección LAMP de ADN ambiental proporciona una vigilancia sensible a gran escala de la esquistosomiasis urogenital posible mediante la identificación de áreas potencialmente amenazadas. En términos más generales, el método eLAMP tiene un gran potencial en enfermedades transmitidas por vectores y ecología.

Está bien establecido que los cambios globales aumentan el riesgo de brotes de enfermedades infecciosas [1,2,3]. Las sucesivas oleadas epidémicas de la última década, como la pandemia de gripe porcina, los numerosos brotes del virus del Ébola en África occidental, el brote del virus del Zika de 2015 y la pandemia de la COVID-19, dieron como resultado una mortalidad y una morbilidad significativas mientras se propagaban a varios países [2]. La incidencia de enfermedades transmitidas por vectores en humanos y animales se ve afectada por el cambio climático y el estilo de vida humano (p. ej., migración, contaminación, urbanización) [1, 4, 5]. Desde hace varios años, muchas de ellas han ido surgiendo o resurgiendo a nivel mundial. Por ejemplo, el rango geográfico del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y la incidencia humana están aumentando en toda Europa, incluida Francia, en áreas que antes no eran endémicas [6]. Aunque la esquistosomiasis es una enfermedad relacionada con la pobreza y la falta de agua potable en los hogares, la infección por esquistosomas se ha identificado en el sur de Europa (Francia y España) [7, 8]. Los vectores gasterópodos liberan larvas de esquistosomas que pueden infectar a los humanos que entran en contacto con cuerpos de agua dulce. En el verano de 2013, se diagnosticaron > 106 casos en Córcega, una isla mediterránea francesa conocida por su atractivo turístico [9, 10]. Desde entonces, algunos casos de transmisión autóctona han persistido año tras año [11]. Para muchas enfermedades parasitarias, los cambios globales conducen a una redistribución espacial de los vectores o de los huéspedes intermediarios que transmiten las enfermedades y también pueden conducir a la aparición de enfermedades [12,13,14,15,16]. El mapeo de áreas de brotes de enfermedades infecciosas es esencial tanto para identificar poblaciones en riesgo de infección como para comunicar y advertir al público [17]. Con respecto a las enfermedades transmitidas por vectores, dado que la transmisión depende de la presencia de los vectores, es necesario mapear sus distribuciones espaciales para el control de enfermedades. Se ha demostrado en varios países africanos que las campañas de control de caracoles juegan un papel importante en el control de las enfermedades transmitidas por caracoles (SBD) y que la aplicación regular de molusquicidas probablemente contribuya a la eliminación de las SBD en áreas de riesgo [18,19,20 ]. Sin embargo, el seguimiento de las SBD, en particular las transmitidas a través de especies de caracoles de agua dulce, es menos evidente. La heterogeneidad espacial y temporal de la distribución de los moluscos de agua dulce explica la dificultad de establecer estos mapas de riesgo [21, 22]. Los métodos de muestreo convencionales son, por lo tanto, laboriosos y lentos, y requieren malacólogos para la identificación taxonómica, que se han vuelto cada vez más escasos en los últimos años con el despegue de la biología molecular. Por lo tanto, actualmente es muy difícil monitorear las poblaciones de caracoles a gran escala espacial y temporal [21, 22].

Se ha considerado el desarrollo de herramientas para simplificar el monitoreo de SBD para abordar este problema, basadas en ADN ambiental (eDNA) [23]. Se desarrollaron métodos de amplificación de eDNA para detectar muchos vectores de parásitos como Aedes albopictus [24] y también hospedadores de caracoles como Galba truncatula y Austropeplea tomentosa [25, 26], ambas especies involucradas en la transmisión de la duela hepática (Fasciola hepatica). La detección de eDNA generalmente se realiza mediante la técnica de amplificación de ADN de PCR cuantitativa. Más recientemente, la detección de eDNA de Oncomelania hupensis y Bulinus truncatus, involucradas en la transmisión de Schistosoma japonicum y Schistosoma haematobium, respectivamente, ha sido posible mediante PCR cuantitativa (qPCR) o PCR de gotitas digitales (ddPCR) [21, 27]. Los resultados obtenidos en estos últimos estudios mostraron detección de alta sensibilidad y especificidad. La detección de eDNA de B. truncatus por ddPCR permitió encontrar hasta 0,06 copias/µl [21]. Esto representa un avance significativo en el desarrollo de herramientas para simplificar el monitoreo de SBD. Sin embargo, todas estas técnicas requieren equipos sofisticados y costosos tanto para la preparación de muestras (es decir, el uso de kits de extracción de ADN costosos y lentos para obtener eDNA sin inhibidores de PCR) como para equipos de amplificación (es decir, LightCycler o ddPCR). Estas técnicas costosas requieren un laboratorio bien equipado, que rara vez está disponible en áreas endémicas de esquistosoma. Todavía se necesita el desarrollo de herramientas rentables y adaptadas al campo para la realización de mapas de distribución de caracoles [17, 23, 28]. La técnica de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) tiene el potencial de hacer esto posible [29,30,31]. Curiosamente, el método LAMP posee todas las características requeridas para la adaptabilidad a las condiciones de campo, particularmente en países de bajos ingresos: velocidad, simplicidad, reactivos liofilizados, bajo costo y robustez contra los inhibidores de la amplificación del ADN [29, 30, 32]. De hecho, utilizando una enzima polimerasa Bst con actividad de desplazamiento de hebra y de cuatro a seis cebadores que se hibridan en seis a ocho regiones de la secuencia diana, la reacción de amplificación de ADN exponencial puede realizarse a temperatura constante, sin desnaturalización previa de las dobles hebras de ADN. De hecho, la hibridación de los cebadores creará estructuras de bucle de tallo en las cadenas recién amplificadas que conducen a la multiplicación exponencial del número de nuevas zonas de inicio de amplificación. Obtenemos finalmente un frotis compuesto por varios fragmentos de tamaños variados que forman una escalera después de la revelación por gel de electroforesis. Por lo tanto, la reacción se realiza muy rápidamente (generalmente < 1 h) a una temperatura constante de alrededor de 63 °C en un bloque de calentamiento simple [29, 31, 33]. Dado que no se requiere un equipo grande o costoso para realizar un LAMP, los estudios recientes se han centrado en el desarrollo de dispositivos portátiles para realizar diagnósticos de campo lo más cerca posible del sitio de muestreo [34,35,36,37]. Debido a su robustez frente a los inhibidores, se puede realizar sobre muestras con una preparación muy simplificada, sin necesidad de kits de extracción de ADN para purificar el ADN, que también se puede realizar en campo [38, 39]. La amplificación de ADN se puede detectar mediante visualización a simple vista, electroforesis en gel o fluorescencia en tiempo real, lo que ofrece flexibilidad de uso en entornos de campo [34, 36]. Estudios recientes han demostrado que es posible detectar eDNA por LAMP [40,41,42,43]. Se desarrolló un LAMP ambiental (eLAMP) para detectar la presencia de bacterias indicadoras fecales en el agua en 1 h, sin equipo de laboratorio sofisticado ni personal altamente capacitado [40]. Dos equipos lograron amplificar eDNA de moluscos (Galba truncatula y Dreissena sp.) de muestras de agua con LAMP [41, 42].

El objetivo de este estudio es desarrollar una herramienta LAMP de diagnóstico rápido para detectar el ADN ambiental de Bulinus truncatus, huésped intermediario de Schistosoma haematobium. La esquistosomiasis es la segunda enfermedad parasitaria más común después de la malaria y sigue siendo una enfermedad tropical desatendida. A pesar de su alta incidencia (230 millones de personas infectadas y 200.000 muertes por año [44]), los esfuerzos para realizar campañas de control del caracol son muy bajos [28, 45, 46]. Sin embargo, en 2017, la OMS pidió reenfocarse en el control de caracoles para mantener el progreso, y pidió a los estados miembros que desarrollen o adapten estrategias nacionales de control de vectores, con el objetivo de reducir la incidencia de enfermedades transmitidas por vectores, incluida la esquistosomiasis, en al menos un 40 % para 2025. [46]. Por lo tanto, se necesitan herramientas rentables y apropiadas para el campo para el mapeo rápido de la distribución de caracoles para esta enfermedad [23]. En comparación con los métodos de amplificación qPCR o ddPCR, el eLAMP parece ventajoso para la aplicabilidad de campo en países de bajos ingresos. Sin embargo, esta ventaja desaparece si el protocolo de extracción de ADN que precede a la amplificación no se adapta a las condiciones de campo, como el uso de kits de extracción de ADN. Nuestro trabajo consistió en (i) el desarrollo de un ensayo eLAMP específico para B. truncatus, (ii) la comparación de los resultados obtenidos por LAMP en un banco de eDNA con los obtenidos por qPCR y ddPCR y (iii) el desarrollo de un protocolo de campo completo de detección

La herramienta de diagnóstico Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) se desarrolló a partir de un banco de ADN ambiental (eDNA) y ADN recién extraído de moluscos.

El banco de eDNA está compuesto por 200 muestras recolectadas previamente en la isla de Córcega, Francia [21]. Estas muestras fueron ADN extraído de membranas de filtración de agua recolectadas en dos ríos distintos del sur de Córcega. La transmisión de la esquistosomiasis urogenital se ha evidenciado recientemente en estos dos ríos [9, 10, 47]. Se recogieron tres volúmenes diferentes de agua (1, 3 y 5 l) tanto de la orilla como de los cauces de los ríos. Se muestrearon cuatro sitios en el río Cavu: el puente Mulinu y los sitios del parque Tyroliana (muestreados por duplicado), el sitio de las tres piscinas donde está presente B. truncatus y el sitio de toma de agua donde B. truncatus está ausente. Se tomaron muestras de un solo sitio del río Solenzara donde B. truncatus está presente. Los controles negativos se realizaron filtrando agua pura de manantial a lo largo del río. Además de estos sitios de muestreo en Córcega, también se tomaron muestras de eDNA de un canal artificial dentro del campus de la Universidad de Perpiñán, donde nunca se ha registrado B. truncatus, como control negativo. El protocolo de extracción de eDNA de las membranas de filtración de agua resultantes se describió anteriormente [21] y se recuerda brevemente aquí: cada membrana de filtración se dividió en cuatro cuartos y se extrajo con el kit DNeasy® Blood & Tissue (QIAGEN). De las 200 muestras, se recolectaron 144 muestras de eDNA donde B. truncatus estaba presente y 56 muestras de eDNA donde no estaba presente B. truncatus, y se amplificaron usando qPCR. Una muestra se consideró positiva si al menos una cuarta parte de la membrana era positiva. Las reacciones de ddPCR se realizaron en grupos de extractos de ADN de los cuatro cuartos de cada membrana (es decir, 50 reacciones) [21]. Los resultados por membrana obtenidos con qPCR y ddPCR se compararon con eLAMP (presente estudio). Los resultados por cuarto de membrana obtenidos por qPCR también se compararon con eLAMP.

Además de los eDNA, y para probar la especificidad de nuestros conjuntos de cebadores, también se extrajo ADN de caracoles de agua dulce (Bulinus sp. y otros géneros filogenéticamente relacionados) utilizando el kit DNeasy® Blood & Tissue (QIAGEN) siguiendo el protocolo de extracción de tejido. Brevemente, después de moler cada caracol, las muestras se colocaron en un Speedvac™ DNA 130 (Savant™, Thermo Scientific™) a 65 °C durante 20 min para eliminar cualquier residuo de alcohol o agua. A continuación, los caracoles se lisaron a 56 °C durante 4 h en una solución que contenía 20 ml de proteinasa K y 180 ml de tampón ATL. Los pasos restantes se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN se midió utilizando un fluorómetro Qubit® 2.0. Estos últimos ADN se diluyeron con agua ultrapura para obtener concentraciones finales de 0,5 ng/µl. Los extractos y diluciones de ADN resultantes se almacenaron luego a -20 °C hasta su uso.

La selección de objetivos de ADN fue exhaustiva para maximizar las posibilidades de éxito en el desarrollo de la herramienta de diagnóstico eLAMP. El ITS2; 5,8S; 18S; COI; y 28S Las regiones de ADN de B. truncatus se descargaron de la base de datos GenBank (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; números de acceso: MH361757 para 5,8S; KJ157340 para 18S [48]; KJ157370 para 28S [48]; MT707426 para COI [49] y MG757890 para ITS2 [50]). Cuando estuvieron disponibles, las secuencias de otras especies de Bulinus se descargaron de la base de datos GenBank para desarrollar una herramienta de detección específica de B. truncatus. El diseño de los juegos de cebadores se llevó a cabo utilizando el software Primer Explorer V5 (Eiken Chemical Co., Ltd., Japón; http://primerexplorer.jp/e/) siguiendo los criterios descritos en "A Guide to LAMP primer designing" (https://primerexplorer.jp/e/). ://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html). Los conjuntos debían cumplir con los siguientes parámetros: longitud de cada iniciador entre 18 y 22 pb; Tm entre 64 y 67 °C para el par F1c/B1c; Tm entre 59 y 62 °C para pares F2/B2 y F3/B3; tasa de GC entre 50 y 65%; Umbral de dG < –4 kcal/mol para estabilidad de 5' y 3' y entre 0 y –1 kcal/mol para control de dímero. La estimación del dímero de cebadores y la estabilidad de cada conjunto de cebadores se verificaron en línea utilizando el "Analizador de cebadores múltiples" (herramienta web Thermo Scientific) y la herramienta OligoAnalyzer™ (IDT™). Todos los cebadores seleccionados fueron sintetizados por Eurogentec (Seraing, Bélgica).

Para cada conjunto de cebadores diseñados, se realizaron varios ensayos de amplificación ajustando los parámetros de la reacción de amplificación (es decir, MgSO4, concentración de cebadores y betaína, tiempo de reacción y temperatura). El protocolo seleccionado fue el siguiente: un volumen total de 10 µl que contenía 1,2 µM de los cebadores internos FIP y BIP, 0,2 µM de los cebadores externos F3 y B3, 0,4 µM de los cebadores LOOP LB y LF, 1,0 mM de cada dNTP ( New England Biolabs), tampón de reacción 1X Isothermal Amplification Buffer II [20 mM Tris–HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 150 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0. 1% Tween® 20, pH 8.8@25 °C (Nuevo England Biolabs, Reino Unido)], MgSO4 adicional 3 mM (New England Biolabs, Reino Unido), betaína 1,2 M y 1 U de polimerasa de ADN Bst 2.0 WarmStart (New England Biolabs, Reino Unido) junto con 2,5 µl de plantilla de ADN. Los tubos de reacción se colocaron en un bloque de calentamiento que funciona con batería a 63 ̊C durante 45 min seguido de una fase de inactivación de enzimas a 80 °C durante 5 min si los resultados no se visualizaban inmediatamente después de la reacción. Las visualizaciones de resultados se realizaron de acuerdo con diferentes protocolos utilizados clásicamente en la amplificación de ADN LAMP: (i) punto final de detección visual de fluorescencia después de agregar 2 μl de SYBR Green (Invitrogen) diluido 1:50 a una concentración de 10,000x (verde: positivo; naranja: negativo ); (ii) detección visual del punto final de los productos LAMP en electroforesis en gel de agarosa al 2% con 2 µl de MIDORI Green Advance (Nippon Genetics) para 50 ml de gel de agarosa, revelado por UV; (iii) detección en tiempo real incorporando Sybr-Green 0,25x en la mezcla de reacción y monitoreando la amplificación en un dispositivo portátil Genie III (Optigene Ltd).

La especificidad de todos los conjuntos de cebadores diseñados se evaluó en plantillas de ADN de 12 especies de caracoles de agua dulce (Tabla 1), incluidos cuatro especímenes del mismo género pero de diferentes especies (es decir, B. forskalii, B. globosus, B. umbilicatus y B. senegalensis) y otros géneros relacionados filogenéticamente. Se evaluaron bulinus truncatus de cinco localidades diferentes (Cuadro 1) para visualizar una posible variabilidad intraespecífica. Solo el conjunto de cebadores que amplificaba exclusivamente el ADN de B. truncatus se mantuvo para los experimentos posteriores.

El límite de detección (LOD) se evaluó mediante ensayos LAMP en ADN de B. truncatus diluido diez veces en serie de 10 ng/µl a 1,10–9 ng/µl antes y después de agregar los cebadores LOOP a la reacción. A partir de la concentración de ADN límite de detección obtenida, se estimó el número de copias diana de B. truncatus por microlitro mediante la siguiente ecuación:

donde Nc = el número de copias diana de B. truncatus por microlitro; C = concentración de ADN de detección límite en ng/µl; V = volumen (aquí, 1 µl); M = masa molar promedio de una base nitrogenada = 309 g/mol; Sg = tamaño del genoma de B. truncatus = 1,2,109 pb; NA = número de Avogadro; NrDNA = número promedio de copias de rDNA en un genoma = 93 copias [51,52,53,54,55,56].

Hemos desarrollado un nuevo protocolo de concentración de eDNA fácil de usar que nos permite aprovechar al máximo los beneficios de campo de LAMP. El agua se recolecta en una botella comercial de plástico limpia en la superficie del cuerpo de agua. Luego, se filtran de 500 ml a 1500 ml de agua a lo largo del río utilizando una unidad de filtración de 0,45 µm (PES VWR 1L 514-0301) y una bomba manual. El agua se filtra hasta que la membrana se bloquea debido al apilamiento de sedimentos. La membrana se corta en cuatro cuartos con una hoja de bisturí y se deposita en un único tubo Falcon™ de 25 ml que contiene 15 ml de tampón de lisis [NaCl 100 mM, EDTA 250 mM, SDS al 5 % y Tris-HCl 10 mM (pH = 8) ]. Las abrazaderas utilizadas para retirar las membranas de las unidades de filtración se descontaminan antes de cada muestreo colocándolas sucesivamente en un baño de lejía al 10 % durante 15 s y luego 15 s en una solución DNA AWAY™ (Thermo Scientific). Después de una agitación vigorosa, el líquido se recoge con una jeringa de 20 ml. El líquido se filtra previamente con una membrana de 40 µm para eliminar los sedimentos más grandes y luego se filtra con un filtro de jeringa Whatman® GD/XP de 0,45 µm (13 mm) (PTFE Sigma Aldrich WHA69742504). El último filtro se lava con 5 ml de agua destilada y se seca con el mismo volumen de aire. El eDNA se recupera finalmente mediante filtración inversa con 500 µl de agua ultrapura gracias a una jeringa acoplada a una aguja dosificadora cónica 18 GA (Metcal).

Este último protocolo se evaluó en dos masas de agua senegalesas investigadas en julio de 2022. El sitio de Lampsar (16°06′29′′N; 16°20′59′′O) y el sitio de Diama (16°12′36′′N; 16°24′10′′W) están situados a lo largo del río Senegal en la región de Saint-Louis, Senegal. En cada sitio, las muestras de agua se recolectaron por triplicado con aproximadamente 10 m entre muestreos. Se recogieron setecientos mililitros, dos veces 500 ml y tres veces 500 ml para los sitios de Lampsar y Diama, respectivamente. En cada sitio se realizaron controles negativos filtrando 1500 ml de agua pura de manantial siguiendo estrictamente el mismo procedimiento que para las muestras biológicas. La presencia en el sitio de B. truncatus fue verificada mediante el muestreo de moluscos durante 1 h por dos malacólogos.

La concordancia entre los resultados obtenidos con el LAMP recientemente desarrollado y la qPCR para la detección de ADN de B. truncatus en la biblioteca de eDNA de 200 campos se analizó estadísticamente calculando un análisis de coeficiente kappa utilizando el paquete psych (versión 2.2.9) en el software R. Las sensibilidades de campo en el banco de eDNA se calcularon con un intervalo de confianza del 95 % utilizando el paquete stats (versión 3.6.2) en el software R.

Se diseñaron un total de 18 juegos de cebadores. Después del ajuste de parámetros y la evaluación de sensibilidad y especificidad, hemos seleccionado el mejor candidato que se dirige al marcador ITS2" (Tabla 2). Un archivo adicional muestra la alineación del cebador en la secuencia ITS2 (ver Archivo adicional 1). dG mínimo de dímero de cebador para este establecido fue –0,93 kcal/mol.

La especificidad de Bt-eLAMP se evaluó analizando el ADN extraído de 11 especies no objetivo y cinco moluscos objetivo de diferentes localidades. La figura 1a muestra que solo se amplifican las cinco muestras de ADN de B. truncatus. La prueba de sensibilidad (Fig. 1b) muestra que el LOD es de 1 fg/µl (es decir, equivalente a aproximadamente Nc = 0,07 copias por microlitro) con un conjunto completo de cebadores (incluidos los cebadores LOOP). El límite de detección fue de 1 pg/µl antes de añadir los cebadores LOOP.

Especificidad y LOD (límite de detección) del ensayo Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP). Resultados obtenidos con electroforesis en gel de agarosa a los 45 min de reacción. una especificidad; carriles 1–5, plantillas de ADN de Bulinus truncatus de cinco localidades diferentes (Diama, Lampsar, Mbane, Corsica y Saneinte); carril 6, Bulinus globosus; carril 7, Bulinus senegalensis; carril 8, Bulinus forskalli; carril 9, Bulinus umbilicatus; carril 10, Biomphalaria glabrata; carril 11, Bitinia tentaculata; carril 12, Ancylus fluviatilis; carril 13, Gyraulus laevis; carril 14, Physa acuta; carril 15, Potamopyrgus antipodarum; carril 16, Pisidium casertanum; carril C+, control positivo (ADN de Bulinus truncatus; 1 ng); carril C-, control negativo (agua como plantilla). b LOD; carril 1–11, diluciones en serie diez veces de ADN de Bulinus truncatus (10 ng/μL a 1 µg/μl); carril C-, control negativo (agua como plantilla)

La Figura 2 muestra la comparación de la precisión de detección entre los métodos de amplificación LAMP, qPCR y ddPCR en muestras de eDNA recolectadas en dos ríos de Córcega. El método Bt-eLAMP proporcionó los mismos resultados que los obtenidos con qPCR y ddPCR. Todas las membranas son positivas excepto la membrana "1LStreambed" del sitio del puente dos de Mulinu. No se detectó ninguna señal positiva de los seis controles negativos de campo o del sitio de la Universidad donde nunca se produjo B. truncatus ni de las muestras recolectadas en el sitio de toma de agua del río Cavu donde no se recolectó B. truncatus (Fig. 2). Considerando los resultados obtenidos por cuarto de membrana donde estuvo presente B. truncatus, 110 de 144 muestras fueron amplificadas exitosamente con LAMP; mientras tanto, 91 de 144 muestras se amplificaron con éxito con qPCR. Las sensibilidades de los métodos LAMP y qPCR se estimaron en 76,4 % (IC 95 % 68,6–83,1) y 63,2 % (IC 95 % 54,8–71,1), respectivamente. La concordancia kappa obtenida con estos resultados es igual a 0,51 (Cuadro 3).

Comparación de la detección de ADN ambiental de Bulinus truncatus mediante la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y los métodos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (ddPCR). Cada celda representa los resultados de la amplificación de ADN del eDNA recolectado en dos ríos de Córcega (Cavu y Solenzara) y el Canal de Perpiñán; Los caracoles Bulinus truncatus están presentes en todos los sitios excepto en el sitio de toma de agua en el río Cavu y el sitio universitario en el canal de Perpiñán. Se recogieron tres volúmenes de agua (1, 3 y 5 l) tanto de la orilla como de los cauces de los ríos en todos los sitios de Córcega. Cada línea representa el resultado de la amplificación de cada sitio usando el método de amplificación LAMP, qPCR o ddPCR. Los resultados de qPCR y ddPCR provienen de Mulero et al. [21]. Una membrana verde significa que al menos una cuarta parte de la membrana de filtración es positiva para la presencia de Bulinus truncatus y una membrana roja significa que ninguna cuarta parte de la membrana de filtración es positiva. Las celdas vacías significan que no se realizó filtración en estas condiciones

El uso de la amplificación LAMP como método de detección fácil de usar se mejoró mediante el desarrollo de un nuevo protocolo de concentración de eDNA que podría realizarse a lo largo de los cuerpos de agua. Todo el protocolo se probó en los sitios de Lampsar y Diama, Senegal. En estos dos sitios, respectivamente, 95 y 229 B. truncatus fueron muestreados por dos malacólogos durante 1 hora de muestreo. Cuatro de los 95 B. truncatus muestreados en el sitio de Lampsar emitieron cercarias después de 2 h de exposición a la luz. Bulinus globosus estuvo presente en ambos sitios. Bulinus forskalii solo estuvo presente en el sitio de Diama, mientras que encontramos Biomphalaria pfeifferi solo en el sitio de Lampsar. Los tres muestreos de eDNA de los dos sitios fueron positivos (Fig. 3) y mostraron una precisión del 100 % del método. Ninguno de los controles negativos fue positivo. Las muestras de eDNA de B. truncatus se amplificaron en promedio 12 minutos después de la amplificación de los controles positivos (ADN extraído de B. truncatus).

Amplificación isotérmica mediada por bucle en tiempo real del ADN ambiental de Bulinus truncatus en los sitios de Diama (a) y Lampsar (b), Senegal. Las líneas naranja, amarilla y verde son muestras analizadas. Las líneas turquesa y azul son controles positivos (1 ng de ADN extraído de B. truncatus). La línea roja es muestra negativa de campo (1500 ml de filtración de agua mineral). Las líneas violeta y rosa son muestras negativas de laboratorio (agua ultrapura)

Los cambios globales están modificando la distribución de las enfermedades transmitidas por vectores al propagar los vectores a áreas que anteriormente no eran endémicas. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de herramientas rentables y adaptadas al campo para mapas de distribución de vectores [17, 28]. En el presente estudio, hemos desarrollado una herramienta de diagnóstico LAMP rápida para detectar el ADN ambiental de un caracol de agua dulce vector (es decir, B. truncatus) de un parásito tropical (es decir, S. haematobium). Nuestro Bt-eLAMP amplificó con éxito una fracción marcadora de ADN ITS2 de B. truncatus después de 45 min de incubación a 63 °C. Ensayos in vitro evidenciaron la alta sensibilidad del Bt-eLAMP con un LOD igual a 1 fg/µl cuando incluía cebadores LOOP. Considerando que el LOD era de 1 pg/µl antes de agregar los cebadores LOOP, deducimos que la adición de cebadores LOOP permite ganar en sensibilidad un factor de 1000. Desde un punto de vista metodológico, esto resalta la importancia de diseñar juegos de cebadores que permitan inclusión de cebadores LOOP. Los límites de detección de las técnicas LAMP desarrolladas están generalmente entre 100 y 0,1 fg/µl [43, 57, 58, 59]. Nuestro LOD es más bajo en comparación con el LOD previamente evaluado para la detección LAMP eDNA del caracol de agua dulce vector de la fasciolosis (Galba truncatula) [41]. Estos últimos autores midieron un LOD de 0,349 pg/μl [41]. Al estimar la equivalencia del número de copias (0,07 copias por microlitro) con el conjunto de cebadores completo (es decir, incluidos los cebadores LOOP), encontramos una sensibilidad cercana a la obtenida con ddPCR (0,06 copias por microlitro) [21]. Nuestro Bt-eLAMP mostró la misma sensibilidad en comparación con la ddPCR, que se considera la técnica de amplificación de ADN más sensible de todas [60, 61].

Nuestro ensayo Bt-eLAMP mostró una especificidad del 100 % para B. truncatus incluso considerando especies de caracoles estrechamente relacionadas. Esto sugiere que el ensayo Bt-eLAMP es lo suficientemente robusto como para detectar eDNA de B. truncatus en áreas donde coexisten otros caracoles sin riesgo de reactividad cruzada. Nuestra herramienta también puede permitir la determinación de especies entre B. truncatus y otras especies de Bulinus como B. globosus, que son morfológicamente indistinguibles. Por otro lado, la utilidad de esta alta especificidad podría cuestionarse si consideramos que especies hermanas de algunos moluscos, como B. globosus, también podrían estar implicadas en la transmisión de la esquistosomiasis urogenital [62]. Sería interesante desarrollar también herramientas de diagnóstico de eDNA que permitan una detección panespecífica tanto de B. truncatus como de B. globosus o de todas las especies del género Bulinus. La dificultad será encontrar un equilibrio entre regiones suficientemente conservadas entre las especies de Bulinus y suficientemente diferentes de otros gasterópodos para obtener un conjunto de cebadores específicos de género. Esta última tarea es más difícil ya que el número de cebadores requeridos en LAMP y las restricciones de posicionamiento entre ellos en la secuencia objetivo aumentan la longitud de la secuencia que se encuentra cumpliendo estos requisitos.

Teniendo en cuenta nuestro banco de eDNA, el método Bt-eLAMP proporcionó exactamente la misma capacidad de detección general en comparación con qPCR o ddPCR [21]. Considerando cada cuarto de membrana, con 76,4 % (95 % IC 68,6–83,1) y 63,2 % (95 % IC 54,8–71,1) de detección positiva usando LAMP o qPCR, respectivamente, el método LAMP mostró una mayor capacidad de detección en comparación con qPCR [21] . El coeficiente kappa destaca un acuerdo moderado entre los dos métodos. Quince cuartos de membrana son negativos en LAMP mientras que son positivos en qPCR; por el contrario, 34 cuartos de membrana son negativos en qPCR y positivos en LAMP. La presencia de inhibidores de la PCR podría explicar estos últimos resultados. De hecho, ya se ha demostrado que, a diferencia de la qPCR, LAMP es resistente a los inhibidores [29, 63].

El desarrollo de métodos de amplificación compatibles con el campo, como LAMP, debe ir acompañado del desarrollo de un preprocesamiento de la muestra compatible con el campo. El uso de kits de extracción de ADN que tienen un bajo rendimiento debido a su alto nivel de purificación requiere aparatos especiales como centrífugas, que son costosos. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo proceso previo de muestra de agua fácil de usar para concentrar el eDNA. El protocolo de muestreo y pre-proceso se realizó en 45 min en campo sin electricidad, lo que representa un avance significativo en el monitoreo de SBDs. Sin embargo, se pueden realizar varias mejoras en nuestro protocolo, especialmente en el paso de filtración de agua. La bomba manual utilizada limita la velocidad y la comodidad del protocolo ya que tomó 30 min por muestra para filtrar apenas 500 ml de agua con dificultades. Se utilizó una bomba de agua de diafragma alimentada por batería de 12 V junto con una cápsula de filtro adaptada para filtrar hasta 50 l de agua en un estudio de ADN dirigido a trematodos en el agua [64]. Para mejorar aún más la viabilidad y la velocidad del ensayo Bt-eLAMP, una bomba mejorada que funciona con batería podría reemplazar la bomba manual. Es necesario probar la compatibilidad entre una bomba motorizada y las unidades de filtro utilizadas en nuestro protocolo.

Usamos el Genie III para obtener nuestros resultados de campo de Senegal, que es una herramienta de campo útil, fácilmente transportable y operada por batería, que permite la visualización de la cinética de reacción. Junto con los reactivos liofilizados, este tipo de dispositivo portátil permite realizar todo el protocolo (muestreo, preproceso, amplificación y revelación) en el campo [32]. Deberíamos usar otro dispositivo portátil para países de bajos ingresos donde el uso del Genie III puede ser un obstáculo financiero. La pandemia global de COVID-19 implicó el desarrollo de varias herramientas para realizar LAMP de bajo costo y fáciles de usar [34, 35, 65,66,67]. Se ha desarrollado un dispositivo de diagnóstico LAMP de código abierto y bajo costo que permite la amplificación en tiempo real y la lectura de fluorescencia de la misma manera que el Genie III [34]. Incluso se ha demostrado que la reacción LAMP se puede realizar utilizando una cápsula de café llena de material de cambio de fase, llamada "T-cup", que permite la incubación a 63 °C en agua hirviendo y una revelación a simple vista [35]. En otro estudio, el paso de revelación de una LAMP basada en un teléfono inteligente podría evaluarse con una aplicación de teléfono inteligente junto con filtros que permiten la lectura de fluorescencia. En el futuro, la prueba LAMP actual debe mejorarse con reactivos liofilizados y este tipo de dispositivo y luego probarse en una muestra grande.

En este estudio, desarrollamos un ensayo LAMP completo y fácil de usar que detecta la presencia del ADN B. truncatus del huésped intermedio del caracol trematodo en el medio ambiente. Debido a las ventajas de LAMP de ser amigable en el campo y permitir muestras de preprocesamiento rentables, la prueba Bt-eLAMP puede ser una herramienta nueva y valiosa para establecer de manera rápida y eficiente mapas de riesgo recurrentes para la esquistosomiasis urogenital. eLAMP también se ha utilizado para detectar la presencia de parásitos intestinales en aguas residuales durante el tratamiento, ofreciendo incluso la posibilidad de buscar Schistosoma sp. eDNA directamente [68]. Sería necesario desarrollar eLAMP para otras especies de Bulinus o Biomphalaria responsables de la transmisión de Schistosoma. eLAMP también podría desarrollarse para otras SBD que tienen las mismas presiones diagnósticas que la esquistosomiasis.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Enfermedad transmitida por caracoles

Amplificación isotérmica mediada por bucle

Amplificación isotérmica mediada por bucle ambiental

Reacción en cadena de la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

Reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

ADN ambiental

Límite de detección

Control positivo

Control negativo

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Un agradecimiento especial a Alassane Ndiaye, quien ayudó a recolectar las muestras de ADN ambiental en el campo. Agradecemos a Celia Robin que trabajó en el proyecto durante su pasantía y diseñó los cebadores LOOP adicionales.

Este estudio fue financiado por la Agencia Francesa para la Seguridad y la Salud Alimentaria, Ambiental y Ocupacional (PNRES 2019/1/059 Molrisk) y la Región de Occitania (programa Schistodiag). Este estudio se realizó con el apoyo de LabEx CeMEB, un programa ANR "Investissements d'avenir" (ANR-10-LABX-04-01), y en el marco de los "Laboratoires d'Excellences (LABEX)" TULIP ( ANR-10LABX-41).

Hosts Pathogens Environment Interactions, UMR 5244, CNRS, IFREMER, UM, Universidad de Perpiñán, Via Domitia, 66860, Perpiñán, Francia

Manon Blin, Jérôme Boissier, Stephen Mulero y Olivier Rey

SAS ParaDev®, 66860, Perpiñán, Francia

Manon Blin & Julien Portela

VITROME, Campus Internacional IRD-UCAD, 1386, Dakar, Senegal

bruno senghor

Universidad Grenoble-Alpes, Universidad. Savoie Mont Blanc, CNRS-LECA, 38000, Grenoble, Francia

Stephen Mulero

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JP, JB, OR y MB concibieron la idea original y diseñaron el estudio. MB realizó el desarrollo de laboratorio del ensayo Bt-eLAMP. JB, BS y MB llevaron a cabo el muestreo de campo. JB y BS proporcionado experiencia malacológica. SM proporcionó el banco eDNA. JB, JP y MB analizaron e interpretaron los datos. JB y MB redactó el manuscrito. BS, JB, SM, OR, JP y MB revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondence to Manon Blin or Julien Portela.

No aplica.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

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Alineación de los cebadores Bt-eLAMP con el marcador ITS2 (número de acceso: MG757890). Cada flecha representa un cebador. Los tonos verdes representan la dirección de la hibridación del cebador (verde oscuro: adelante; verde claro: atrás).

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Blin, M., Senghor, B., Boissier, J. et al. Desarrollo de una herramienta de diagnóstico de amplificación isotérmica mediada por bucle ambiental (eLAMP) para la detección de campo de Bulinus truncatus. Vectores de parásitos 16, 78 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05705-4

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Recibido: 24 noviembre 2022

Aceptado: 15 febrero 2023

Publicado: 28 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05705-4

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