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Nov 01, 2023

Remodelación estructural del carbono

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1001 (2023) Citar este artículo

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En Escherichia coli, el operón phn de 14 cistrones que codifica la liasa de carbono-fósforo permite la utilización de fósforo de una amplia gama de compuestos de fosfonato estables que contienen un enlace CP. Como parte de una vía compleja de varios pasos, se demostró que la subunidad PhnJ escinde el enlace CP a través de un mecanismo radical; sin embargo, los detalles de la reacción no pudieron conciliarse inmediatamente con la estructura cristalina de un núcleo de liasa PhnGHIJ CP de 220 kDa complejo, dejando una brecha significativa en nuestra comprensión de la descomposición de fosfonatos en bacterias. Aquí, mostramos usando microscopía electrónica criogénica de una sola partícula que PhnJ media en la unión de un dímero doble de las proteínas del cassette de unión a ATP, PhnK y PhnL, al complejo central. La hidrólisis de ATP induce una remodelación estructural drástica que conduce a la apertura del complejo central y la reconfiguración de un sitio activo putativo y de unión a metales ubicado en la interfaz entre las subunidades PhnI y PhnJ.

Las bacterias han desarrollado mecanismos elaborados para extraer macronutrientes esenciales, como fósforo, azufre, nitrógeno y carbono, de sus entornos. En Escherichia coli gramnegativa, la limitación de fosfato induce el regulón Pho y la expresión del operón phn de 14 cistrones (phnCDEFGHIJKLMNOP), lo que permite la absorción y descomposición de fosfonatos como fuente alternativa de fósforo1,2,3. Los fosfonatos son estructuralmente similares a los ésteres de fosfato y otros metabolitos primarios, pero contienen un enlace carbono-fósforo (C-P) altamente estable, que es resistente a la escisión hidrolítica4. Por lo tanto, los fosfonatos pueden funcionar como inhibidores y análogos del estado de transición y son muy útiles en la industria como detergentes, herbicidas (p. ej., glifosato/RoundUp®) y antibióticos5. El operón phn codifica un importador de cassette de unión a ATP (ABC) (PhnCE) y una proteína de unión periplásmica (PhnD) para la captación de fosfonato6, un regulador transcripcional (PhnF)7, además de la maquinaria enzimática completa (PhnGHIJKLMNOP) necesaria para la degradación y la incorporación al metabolismo general a través del 5-fosfo-α-D-ribosil-1-difosfato (PRPP)8,9,10,11. La ruta de la liasa C-P tiene un espectro de sustrato notablemente amplio y es capaz de manejar fosfonatos alifáticos y aromáticos voluminosos10,12,13. Por esta razón, y debido a las muchas aplicaciones de los fosfonatos, existe un gran interés fundamental en comprender el mecanismo de descomposición de los fosfonatos por parte de la liasa C-P. Los estudios funcionales y mecánicos detallados de las subunidades enzimáticas individuales codificadas por el operón phn han conducido a un mecanismo de reacción propuesto en el que la fracción fosfonato se acopla inicialmente a ATP o GTP a través del desplazamiento de la nucleobase en una reacción catalizada por PhnI y en presencia de PhnG, PhnH y PhnL8. Se demostró que PhnM libera pirofosfato del 5'-fosforribosil-α-1-fosfonato resultante para permitir que PhnJ escinda el enlace C-P a través de un mecanismo de reacción de radicales de glicina dependiente de S-adenosil metionina (SAM) estrictamente anaeróbico. Finalmente, la acción combinada de PhnP y PhnN convierte la ribosa cíclica resultante en PRPP (Fig. 1 complementaria) 9,10.

Sin embargo, debido a la complejidad de la reacción, la gran cantidad de subunidades y complejos de proteínas involucrados y el requerimiento anaeróbico, aún no ha sido posible obtener una comprensión completa y mecánica de la vía de la liasa C-P. La estructura cristalina de un complejo enzimático central, Phn(GHIJ)2, reveló un heterooctámero simétrico que consiste en un tetrámero central compacto de las subunidades PhnI y PhnG, cada una de las cuales interactúa individualmente con las subunidades PhnJ y PhnH más distales14. Una característica intrigante de esta estructura es que el sitio del grupo Fe4S4, presumiblemente requerido para la formación de radicales y la activación enzimática, está ubicado a una distancia significativa (30 Å) de un residuo de glicina en PhnJ, que según estudios de intercambio de deuterio demostraron ser la ubicación estable de un radical entre ciclos de recambio enzimático15. La estructura cristalina también reveló otro supuesto sitio activo en la interfaz de PhnI y PhnJ que contenía un ion Zn2+ coordinado por dos residuos de His conservados en PhnI, ambos demostraron ser esenciales para el crecimiento en fosfonato. Finalmente, se encontró que de los dos módulos ABC no transportadores codificados por el operón phn, PhnK y PhnL, una sola subunidad de PhnK puede unirse a PhnJ a través de una región helicoidal conservada conocida como dominio de inserción central (CID)14. En las bacterias, los módulos ABC se asocian principalmente con importadores de metabolitos donde interactúan como dímeros con un dominio transmembrana para unir e hidrolizar ATP, generando así la energía y el movimiento necesarios para el transporte contra un gradiente de concentración16. Por lo tanto, la estructura dimérica general de los módulos ABC ofreció poco para comprender la función de la única subunidad PhnK unida al complejo central de liasa C-P. Además, esta discrepancia sugirió que la estructura observada podría no representar un verdadero estado funcional de la enzima y no proporcionó una justificación para la presencia del otro módulo ABC esencial, PhnL. En este trabajo, mostramos genética y enzimáticamente que la actividad ATPasa de PhnK y PhnL es necesaria para el crecimiento de E. coli en fosfonatos y usamos microscopía electrónica criogénica (crio-EM) para revelar un dímero doble de las dos subunidades en C–P complejo de núcleo de liasa. El análisis estructural en condiciones de recambio de ATP revela además que la hidrólisis conduce a la apertura del complejo central que expone y reorganiza el sitio activo Zn2+ ubicado entre las subunidades PhnI y PhnJ.

Para comprender mejor la interacción de las subunidades ABC con la liasa C-P y el papel de estos módulos en la catálisis, inicialmente purificamos el complejo central unido a PhnK de un plásmido que codifica PhnGHIJK con PhnK marcado con His como se describió previamente14 y determinamos una alta resolución. estructura del complejo de liasa C – P purificado por crio-EM (Fig. 2a complementaria y Fig. 3 complementaria). Un mapa inicial generado utilizando 901.800 partículas dio como resultado una estructura con una resolución general de 2,2 Å (utilizando el criterio de corte de 0,143 de correlación de capa de Fourier (FSC) estándar de oro17) del complejo central de liasa C-P unido a una sola subunidad PhnK como observado previamente (fig. 1a)14,16. PhnK mostró una resolución significativamente más baja que el complejo central PhnGHIJ, por lo que usamos la clasificación 3D con resta de señal para enfocar el refinamiento en PhnK y obtuvimos una clase final que consta de 50 323 partículas con una resolución de 2,6 Å. Este mapa había mejorado la densidad de PhnK y permitió rastrear el pliegue completo de la proteína (Fig. 1a, Fig. 3 complementaria y Tabla 1 complementaria). El análisis de variabilidad reveló varias posiciones distintas de PhnK que representan un movimiento similar a una bisagra del dominio ABC alrededor del sitio de interacción (Fig. 1b) 18,19. La interacción específica de PhnK con el CID de PhnJ está impulsada principalmente por interacciones electrostáticas que involucran residuos cargados negativamente en PhnJ (Glu149, Asp226, Asp228 y Asp229) y un parche positivo en PhnK (Arg78, Arg82 y Arg116) (Fig. 1c , d). Estas interacciones se estabilizan aún más mediante la interacción hidrofóbica entre PhnJ Tyr158 y PhnK Tyr118. PhnK adopta un pliegue clásico de dominio de unión a nucleótidos (NBD) similar a los dominios citoplásmicos de los transportadores ABC y contiene todos los motivos catalíticos conservados (Walker A / B, bucle Q, firma ABC e interruptor H, Fig. 1d, e), varios de los cuales están directamente involucrados en la unión e hidrólisis del ATP20. En un subconjunto de clases 3D, la densidad EM adicional era visible cerca del bucle P de PhnK (Fig. 1e y Fig. 2b complementaria). La densidad se superpone parcialmente con la de ATP dentro de los módulos NBD en los transportadores ABC (Fig. 1f), pero la falta de características de alta resolución sugiere que cualquier unión de nucleótidos está desordenada y, en consecuencia, que PhnK no está en un estado catalíticamente competente. Esto es consistente con el entendimiento general de que los módulos ABC solo están activos en su estado dimérico. En resumen, concluimos que cuando una sola subunidad PhnK se une al complejo central de liasa C-P, está estructuralmente desordenada y no puede participar en la hidrólisis de ATP. Además, y en contraste con las observaciones anteriores16, no observamos cambios estructurales significativos en el complejo central de PhnGHIJ, incluido el supuesto sitio del grupo Fe4S4, tras la unión de una sola subunidad PhnK (rmsd = 0.5 Å, Fig. 2c complementaria).

a Descripción general de la estructura del complejo central de liasa C–P (PhnGHIJ, azul/verde) unido a una sola subunidad de PhnK (rojo) con los nombres de las subunidades individuales indicados. El bolsillo de unión a ATP de PhnK se muestra con una elipse azul. b Representación superficial de la densidad EM que muestra la extensión del movimiento de inclinación observado en PhnK. Los dos estados extremos se muestran en gris y rojo, respectivamente. c Primer plano de la interacción entre PhnK (rojo) y el dominio de inserción central de PhnJ (CID, azul) con residuos relevantes que se muestran como palos etiquetados e interacciones con líneas discontinuas. d Descripción general de la estructura del dominio de PhnK (arriba, rojo) y PhnJ (abajo, azul) con números de residuos indicados. Para PhnK, la ubicación de los motivos ABC centrales (Walker A y B, bucle Q, motivo característico e interruptor H) se indican en naranja y el dominio C-terminal en rojo oscuro. Para PhnJ, las características que distinguen la proteína de PhnH con la que es homóloga (el dominio de inserción central, CID, residuos 129–169 y el dominio C-terminal, CTD, residuos 235–281) se muestran en azul más oscuro. Los cuatro residuos de Cys cerca del extremo C implicados en la unión del grupo Fe4S4 se indican con C. Las interacciones entre las proteínas se muestran con líneas discontinuas. e Vista de primer plano de PhnK con residuos catalíticamente importantes (Tyr15, bucle A; Gln90, bucle Q; Asp170/Glu171, motivo Walker A; His204, bucle H) que se muestran como barras. Una densidad adicional observada en varias clases 3D en el sitio de unión de nucleótidos se muestra en azul. f Estructura del dominio ABC del transportador multifármaco Sav1866 de S. aureus (2ONJ)24 en la misma orientación que el nucleótido (AMPPNP) y residuos catalíticamente importantes (Tyr349, bucle A; Gln422, bucle Q; Glu503, motivo Walker A; His534, H bucle) como palos y el ion Mg2+ como una esfera púrpura.

Para capturar PhnK en una conformación unida a nucleótidos estable, introdujimos la mutación E171Q en el motivo Walker B (Fig. 1e), que se sabe que permite la unión, pero no la hidrólisis, de ATP en los módulos ABC21. Luego purificamos el complejo de CP liasa tal como se expresa a partir de un plásmido que codifica la maquinaria enzimática completa (PhnGHIJKLMNOP) usando una etiqueta doble Strep C-terminal en PhnK y en presencia del análogo de ATP no hidrolizable, β, γ-imidoadenosina 5 ' -trifosfato (AMPPNP). La determinación de la estructura mediante el análisis de una sola partícula crio-EM a una resolución de 2,1 Å (59 737 partículas, simetría C2, figura complementaria 4 y tabla complementaria 1) reveló el complejo central unido a un dímero de PhnK en una conformación que recuerda al estado unido a ATP de transportadores ABC (Fig. 2a, b, subunidades rojas). En la interfaz de las dos subunidades PhnK, la densidad clara para AMPPNP permitió el modelado de un nucleótido en ambos bolsillos del sitio activo (Fig. 2c y Fig. 5a complementaria). Dentro de PhnK, el nucleótido de adenosina se une de una manera muy similar a lo que se ha observado para los módulos ABC asociados a la membrana (Fig. 5d complementaria). No se observan diferencias estructurales entre el complejo central de liasa C-P cuando se asocia con el estado dimérico de PhnK unido a ATP en comparación con cuando se une una sola subunidad de PhnK (rmsd = 0.3 Å, Fig. 5e complementaria). Sorprendentemente, esta estructura también reveló dos copias de una proteína adicional situada encima de las subunidades PhnK, que pudimos identificar como PhnL por espectrometría de masas e inspección de la densidad EM (Fig. 2a, b, subunidades amarillas y Fig. 6a complementaria). ). PhnL tiene un pliegue NBD como PhnK y se diferencia por la falta de un dominio C-terminal conservado que también se encuentra en los módulos ABC de los transportadores y por la presencia de una horquilla β larga cerca del extremo N que resulta de la extensión de β1 y β2 (Fig. 2a, b, extensión β, verde). La asociación de una subunidad PhnL con cada una de las dos subunidades PhnK genera un dímero doble de subunidades ABC, ambas en la misma orientación entre sí y con el complejo central y, por lo tanto, potencialmente capaces de unirse a nucleótidos. En este complejo heterododecamérico de 327 kDa, PhnL se encuentra en un estado similar al ADP abierto sin densidad visible para un nucleótido. La interacción entre PhnK y PhnL está mediada por una amplia gama de interacciones específicas, principalmente a través del dominio C terminal extendido de PhnK, que contiene dos hélices α (α8 y α9) que facilitan la mayoría de los contactos con PhnL, incluida su horquilla β extendida (Fig. .2d–f). Las interacciones son principalmente iónicas con la región de unión (lado superior) de PhnK que tiene una carga negativa general (residuos 231-247) y con PhnL (lado inferior) con carga positiva (Fig. 6b complementaria). Además, hay un apilamiento π–π entre PhnK Trp29 y PhnL Arg82 (Fig. 2d). El Arg en PhnL está completamente conservado en ortólogos, mientras que el Trp en PhnK está funcionalmente conservado por su capacidad de apilamiento (Fig. 6c complementaria). En resumen, concluimos que ambas subunidades ABC no transportadoras codificadas por el operón phn, PhnK y PhnL, pueden unirse simultáneamente al complejo central de liasa C-P en una conformación de doble dímero con PhnK en el estado unido a ATP y PhnL en un estado abierto compatible con la unión de ATP tras el cierre. Hasta donde sabemos, este tipo de interacción entre dos dímeros ABC no se ha observado antes y, por lo tanto, representa un modo funcional no reconocido hasta ahora de los dominios de unión a nucleótidos ABC.

a Arriba, una descripción general de la estructura del dominio y las características de las secuencias de PhnL (arriba, amarillo) y PhnK (abajo, rojo) con números de residuos indicados. Los motivos principales de la ATPasa (Walker A y B, bucle Q, motivo característico e interruptor H) se indican en naranja, la extensión de horquilla β de PhnL (residuos 7–14) se muestra en verde y el dominio C-terminal de PhnK es se muestra en rojo oscuro. Las interacciones entre las proteínas se muestran con líneas discontinuas. b Una descripción general de la estructura de PhnGHIJKL con el complejo central de CP liasa PhnGHIJ en tonos de azul/verde y los colores claros correspondientes para la otra mitad, el dímero PhnK en rojo/rojo claro y el dímero PhnL en amarillo/amarillo claro. Los recuadros indican la ubicación aproximada de las vistas de primer plano (c–f). c Detalles del sitio de unión PhnK ATP con el AMPPNP (blanco/naranja) que se muestra junto con las cadenas laterales relevantes que interactúan (palos etiquetados) y el ion Mg2+ como una esfera azul. d Interacción de apilamiento observada entre PhnK Trp29 y PhnL Arg82. e Interacción entre el extremo C de PhnK (hélices α8 y α9, residuos 236–247) y la extensión de horquilla PhnL β (residuos 7–14). f Interacciones cargadas observadas entre la región C-terminal de PhnK (residuos 210–236) y PhnL.

Para sondear la importancia de las interacciones específicas entre PhnK y el complejo central, así como la integridad funcional de PhnK y PhnL para la descomposición de fosfonatos, usamos la complementación genética para probar si la alteración de residuos específicos afectaría la capacidad de E. coli para crecer en fosfonato como única fuente de fósforo (Fig. 3a). La cepa de E. coli HO1488 (ΔphnHIJKLMNOP), que carece de la capacidad de crecer en fosfonato, se puede rescatar mediante la introducción de una copia del operón phn transmitida por un plásmido (pSKA03, consulte Métodos para obtener detalles) y, por lo tanto, se puede usar para probar los efectos funcionales. de mutantes de las proteínas individuales. Inicialmente, pudimos demostrar que la incapacidad de la cepa HO1488 para crecer en medios mínimos que contienen metilfosfonato o 2-aminoetilfosfonato podría complementarse genéticamente con la introducción de pSKA03 (Fig. 3a). Interrupción de residuos clave ubicados en la interfaz de interacción PhnK-PhnJ (PhnJ E149A, Y158A o PhnK R78A/R82A) o inhibición de la actividad ATPasa de PhnK o PhnL por mutación del glutamato catalíticamente activo (PhnK E171Q o PhnL E175Q)21 nuevamente abolida crecimiento sobre fosfonato como única fuente de fósforo. Juntos, esto demuestra que tanto la interacción de PhnK y PhnL con el complejo central como la actividad ATPasa de estas subunidades son necesarias para la degradación de fosfonato in vivo.

un ensayo funcional in vivo utilizando la cepa E. coli HO1488 (ΔphnHIJKLMNOP) cultivada sin plásmido (-) o complementada con pSKA03 que contiene el operón phn completo, incluida la caja pho y que incluye las siguientes mutaciones específicas: wt (ninguna), PhnJ Y158A, PhnJ E149A, PhnK R78A/R82A, PhnK E171Q y PhnL E175Q. Las células se sembraron en placas de agar mínimo MOPS44 que contenían K2HPO4, 2-AmEtPn, MePn o ninguna fuente de fósforo añadida (sin P) como se indica. Las placas son representativas de dos repeticiones. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b Actividad de ATPasa usando Phn(GHIJKL)2 de tipo salvaje purificado, Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q (PhnK E171Q) y Phn(GHIJKL)2-PhnL E175Q (PhnL E175Q) medida por separación de especies de nucleótidos por cromatografía de intercambio iónico después de la noche incubación con ATP. c Ensayo acoplado de actividad ATPasa (μmol/min/mg) usando Phn(GHIJKL)2 de tipo salvaje (wt), Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q (PhnK E171Q), Phn(GHIJKL)2-PhnL E175Q (PhnL E175Q) y el doble mutante Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q-PhnL E175Q (E171Q/E175Q). Las barras muestran la media de tres reacciones independientes y las barras de error muestran la desviación estándar de la media. Se excluyó una medición con valor negativo de E171Q/E175Q. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que la hidrólisis de ATP es esencial para la capacidad de E. coli para crecer en fosfonato, luego preguntamos si el complejo central de liasa C-P unido a PhnK y PhnL, Phn (GHIJKL) 2, es activo en la hidrólisis de ATP in vitro. Para responder a esto, el tipo salvaje purificado, así como los complejos inactivados de PhnK y PhnL (Fig. 7a, b complementarias), se analizaron individualmente para determinar la actividad de ATPasa mediante incubación con ATP y Mg2+ seguido de separación cromatográfica de nucleótidos (Fig. 3b) también como por un ensayo de ATPasa enzimática acoplada (Fig. 3c). Ambas técnicas revelaron una clara actividad ATPasa para el complejo PhnGHIJKL de tipo salvaje, mientras que el complejo Phn (GHIJ) 2K mostró una actividad insignificante (Fig. 7c complementaria), de acuerdo con el requisito de la presencia de un dímero ABC completo para la actividad ATPasa. Para los mutantes individuales PhnK E171Q y PhnL E171Q, observamos una actividad ATPasa significativamente reducida, que fue ligeramente más pronunciada cuando PhnK estaba inactivo, mientras que para el mutante doble PhnK E171Q/PhnL E171Q, la actividad estaba completamente ausente (Fig. 3c). En resumen, nuestros datos funcionales muestran claramente que la actividad ATPasa de C-P liasa requiere un dímero de subunidades ABC y que tanto PhnK como PhnL son necesarios para una actividad máxima tanto in vivo como in vitro. Además, ambas subunidades deben poder unirse al complejo central de liasa C-P para que se produzca la descomposición del fosfonato in vivo.

Para capturar estados conformacionales adicionales potenciales del complejo resultante de la actividad ATPasa en PhnK y PhnL, luego purificamos el complejo Phn (GHIJKL) 2 de tipo salvaje en presencia de ATP y EDTA (para prevenir inicialmente la hidrólisis de ATP por PhnK), luego agregamos exceso de Mg2+ para iniciar la reacción inmediatamente antes de manchar las rejillas crio-EM y congelar por inmersión. La recopilación y el procesamiento de datos crio-EM en estas condiciones produjeron estructuras de varios estados funcionales, incluida una estructura de alta resolución del complejo Phn (GHIJKL) 2 que se extiende a 1.9 Å usando un conjunto final de 222,056 partículas e imponiendo simetría C2 (Figs. 8 y 9 y Tabla Suplementaria 1). Este estado es esencialmente idéntico a la estructura determinada en presencia de AMPPNP, sin embargo, una inspección minuciosa del sitio activo de PhnK en el mapa EM de alta resolución reveló que contiene ADP y Pi y, en consecuencia, representa un verdadero estado post-hidrólisis de ATP (Suplementario Figura 5b). También observamos la unión de ATP a ambos sitios de unión de nucleótidos en PhnL, pero a pesar de esto, el dímero todavía está en un estado abierto similar al ADP (Fig. 10a complementaria).

La clasificación 3D de los datos recopilados en condiciones de rotación de ATP produjo estructuras de dos estados adicionales del complejo central unido a PhnK y, en algunos casos, PhnL (Fig. 4a, b y Figs. 8 y 9 complementarias, y Tabla complementaria 1). En ambas estructuras, la densidad de PhnK es significativamente más pobre que en el estado estable unido a PhnL, lo que sugiere que es más flexible y, posiblemente, por lo tanto, PhnL actúa para estabilizar la conformación cerrada de PhnK (Figura complementaria 10b, c). En una de estas conformaciones (cerrada, 2,0 Å, 81 605 partículas, simetría C2), el dímero PhnK está en el estado cerrado unido a ATP y se parece al que se encuentra en las estructuras Phn(GHIJKL)2 mientras que la densidad de PhnL está ausente. La inspección del sitio activo revela una densidad clara tanto para ATP como para Mg2+, lo que sugiere que se trata de un estado unido a ATP prehidrolítico (Fig. 4a y Figs. complementarias 5c y 10d, e). En la otra estructura (abierta, 2.6 Å, 31.280 partículas, simetría C1), una de las dos subunidades PhnK se ha alejado de la posición cerrada 25 Å mientras que la otra permanece en su lugar (Fig. 4b).

Resumen de los cambios estructurales que tienen lugar en el complejo Phn(GHIJK)2 entre los estados cerrado (a) y abierto (b). El complejo Phn(GHIJK)2 se muestra como una representación superficial con el complejo central de liasa C–P en tonos de azul/verde y PhnK en rojo/rojo claro. La flecha indica la extensión de la apertura en el sitio Zn2+. c Detalles del presunto sitio activo en la interfaz entre PhnI y PhnJ en los estados cerrado (arriba) y abierto (abajo). El ion Zn2+ se muestra como una esfera gris con geometría de coordinación indicada y residuos relevantes que interactúan con palos etiquetados. d Detalles del bolsillo del sitio activo con una molécula unida de 5-fosfo-α-D-ribosa-1,2-cíclico-fosfato (PRcP) como se modela en los estados cerrado (arriba) y abierto (abajo). e Movimiento coordinado del extremo PhnI N y el extremo PhnG C desde la superficie del complejo PhnGHIJK en estado cerrado (arriba) hasta el sitio activo en estado abierto (abajo).

Debido a la unión de PhnK al complejo central, este movimiento también da como resultado que un conjunto de subunidades PhnJ y PhnH se separe del resto del núcleo y, en ese proceso, exponga el sitio activo putativo y de unión a Zn2+ ubicado en PhnI-PhnJ. interfaz (Fig. 4b). Ambas subunidades de PhnK parecen flexibles (similares a la estructura con un solo límite de subunidad de PhnK) y muestran una resolución local significativamente más baja que el resto del complejo. Debido a esta flexibilidad, PhnL no se pudo modelar en estado abierto, pero la inspección de las clases 2D confirma que está presente y posiblemente en una conformación cerrada similar a ATP (Figura complementaria 10d, e). Esto sugiere que la apertura del dímero PhnK podría ser el desencadenante que activa la hidrólisis de PhnL ATP. Debido a la flexibilidad, no está claro si PhnL también está presente en el estado cerrado (posterior a la hidrólisis de ATP).

Dado que el complejo central ha aparecido monolítico en todas las estructuras anteriores, el movimiento concomitante de PhnK, PhnJ y PhnH en estado abierto representa un reordenamiento arquitectónico en C-P liasa con implicaciones funcionales significativas. En el estado cerrado, ambas subunidades PhnI y una subunidad PhnJ interactúan estrechamente para formar un sitio de unión a Zn2+ ubicado en la interfaz de las tres proteínas (el sitio His)14. Además de dos residuos de histidina provenientes de PhnI (His328, His333), el ion Zn2+ está coordinado por tres moléculas de agua y un oxígeno de un ligando desconocido, que también se observó previamente mediante cristalografía de rayos X, en una disposición octaédrica (Fig. 4c, cerrado y complementario Fig. 11a)14. Con base en la inspección de la densidad EM, pudimos modelar el ligando como 5-fosfo-α-D-ribosa-1,2-cíclico-fosfato (PRcP, Figs. complementarias 1 y 11b) 8,10. Si bien este es un intermediario de la ruta de la liasa C-P, la expresión de la proteína se llevó a cabo en ausencia de fosfonatos y, por lo tanto, creemos que podría haberse formado en una reacción secundaria durante la sobreexpresión en ausencia de fosfonato y se llevó a cabo durante purificación. Debido a las diminutas cantidades del compuesto presente (dos moléculas por complejo de 350 kDa), los intentos de identificarlo mediante análisis diferencial UPLC-QTOF-MS no tuvieron éxito. El ligando está fuertemente unido a este sitio con interacciones específicas entre el resto de ribosa y PhnJ Arg107 y Gln124, contactos entre el fosfato 5 'y un bucle (residuos 47–50) en PhnJ y finalmente entre dos átomos de oxígeno del 1,2- fosfato cíclico, PhnJ His108 y Zn2+ (Fig. 11b complementaria). También observamos que hay una gran cavidad junto a lo que correspondería a la posición del átomo de fosfonato de un sustrato natural en esta orientación, lo que respalda que el compuesto unido imita un intermedio de reacción y podría explicar la amplia especificidad de sustrato de C-P. liasa (Fig. 11c complementaria).

Por el contrario, no se observa densidad de ligando en el sitio Zn2+ en estado abierto, que ha sufrido un reordenamiento, por lo que el bucle de PhnJ que interacciona con el fosfato 5′ del ligando en estado cerrado se ha remodelado por completo (fig. 4d), lo que permite que His219 de una cadena PhnI cercana y el grupo N-terminal NH2 de PhnI completen la esfera de coordinación Zn2+, que ahora es tetraédrica (Fig. 4c, abierta y Fig. 11d complementaria). Mientras tanto, His108 de PhnJ, que interactúa con el grupo fosfato cíclico 1,2 de PRcP en el estado cerrado, se ha alejado ~11 Å del ion metálico. Hay muy pocos reordenamientos internos en PhnJ y PhnH, que parecen moverse como cuerpos rígidos cercanos (rmsd = 0,6 Å entre las estructuras de estado abierto y cerrado de estas subunidades), excepto el bucle PhnJ 37-49 que recubre el bolsillo del sitio activo y parece ayudar a acomodar los reordenamientos alrededor del ion Zn2+. Esto también significa que no hay cambios en la relación estructural y la distancia entre el supuesto sitio del grupo Fe4S4 que involucra los residuos de cisteína PhnJ 241, 244, 266 y 272 y el sitio radical propuesto en PhnJ Gly32. En el estado abierto del complejo central, Gly32 está enterrado dentro de PhnJ a unos 10 Å de la superficie cerca de la cavidad del sitio activo y a 31 Å del ion Zn2+ (Fig. 11e complementaria).

El término C extendido de PhnG, que en el estado cerrado se encuentra en el exterior del complejo central de liasa C-P y forma interacciones estrechas con el término N de PhnI usando un pequeño motivo β antiparalelo, se transporta junto con PhnI N terminal cuando se traslada al sitio Zn2+ y se guarda en un bolsillo en PhnJ (Fig. 4e). Juntos, los terminales PhnI y PhnG, por lo tanto, experimentan movimientos concertados, en ambos casos de más de 30 Å, un cambio estructural que probablemente tenga varias implicaciones funcionales importantes. Observamos que la participación de ambas cadenas de PhnI en la coordinación de Zn2+ en el estado abierto también explica, junto con el requisito de simetría para unir un dímero ABC, por qué el complejo central de liasa C-P debe ser un dímero de PhnGHIJ, resolviendo así un problema largo. -enigma permanente sobre la razón de la estructura de orden superior de C-P liasa.

En este trabajo, presentamos estructuras de varios estados del complejo central de CP liasa de E. coli unido a los módulos ABC PhnK y PhnL que muestran que ni su interacción con el núcleo ni la unión de ATP alteran la conformación de la enzima. Esto es diferente del papel clásico de los módulos ABC en los transportadores, donde se sabe que la unión de ATP induce un estado más compacto, así como cambios en el segmento transmembrana que dan como resultado la eversión y el estado abierto hacia afuera22. Por lo tanto, parece que el estado fundamental estable del complejo central de liasa C-P (es decir, el observado en ausencia de los módulos ABC) es compatible con la conformación de PhnK unida a ATP. También mostramos que la presencia de un dímero de PhnK en el complejo central de liasa C-P da como resultado la asociación de un dímero similar del módulo ABC homólogo, PhnL, en una disposición de doble ATPasa. Y lo que es más importante, pudimos demostrar que tanto in vivo como in vitro, la actividad de ambos módulos ABC es necesaria para la renovación de ATP. Si bien aún no está claro por qué y cuándo se requiere la actividad ATPasa durante la descomposición del fosfonato, esta observación plantea varias preguntas con respecto a la activación de las ATPasas y si la hidrólisis de ATP ocurre simultánea o secuencialmente en los dos conjuntos de proteínas. La determinación de la estructura en condiciones de rotación de ATP nos permitió capturar una estructura cerrada posterior a la hidrólisis para PhnK unida al complejo central y ADP + Pi. Para los transportadores ABC, esta conformación es difícil de capturar debido a la rápida liberación de Pi y energía tras la hidrólisis de ATP23, por lo que este resultado podría sugerir que PhnL sirve para controlar la liberación de fosfato de PhnK y, por lo tanto, potencialmente también brinda una explicación para el requisito de dos tipos de módulos ABC.

Tanto PhnK como PhnL se unen en la misma orientación en relación con sus socios, el complejo central de liasa C-P y PhnK, respectivamente, ya que los NBD correspondientes se unen a los dominios transmembrana en los transportadores ABC, pero la estructura de la región que interactúa difiere en ambos casos. de la hélice de acoplamiento típica que se encuentra en los transportadores ABC (Fig. 5). En ambos casos, la interacción entre el NBD y su pareja utiliza otra geometría de unión y parece requerir elementos especiales, como la horquilla β extendida en PhnL y el dominio C terminal de PhnK (Figs. 2a, b y Fig. 5). Curiosamente, este dominio C-terminal se encuentra a menudo en los módulos ABC de los transportadores, como el transportador de múltiples fármacos Staphylococcus aureus, Sav1866 (Figs. 5a y 5d)24. El doble dímero de PhnK y PhnL observado en la liasa C-P no se ha observado antes entre los módulos ABC y, por lo tanto, amplía significativamente el repertorio de cómo estas proteínas pueden interactuar con los socios. Además, dado que el complejo central de liasa C-P no está relacionado con los segmentos transmembrana de los transportadores, también indica que el pliegue general del socio de unión ABC es de menor importancia para la interacción que las interacciones específicas en la interfaz. Como se planteó anteriormente, PhnL podría funcionar potencialmente para inhibir la liberación de Pi de la hidrólisis posterior de PhnK y, por lo tanto, controlar cuándo se libera la energía generada a partir de la hidrólisis de ATP, lo que probablemente rompa el complejo central como se muestra. La densidad de EM sugiere que la región C-terminal de PhnK se vuelve más ordenada en presencia de PhnL (Figura complementaria 10b, c). Este efecto se extiende hacia la hélice 6 y el bucle D, que podría actuar como una puerta para controlar la liberación de Pi. En este modelo, la estabilización del bucle PhnK D por PhnL evitaría la liberación de Pi.

a Descripción general de la estructura del transportador ABC de S. aureus Sav1866 en la conformación unida a ADP con el módulo ABC en verde y el dominio transmembrana en gris, excepto por la hélice de acoplamiento, responsable de la interacción entre los dos, que se muestra en cian (2HYD)24 b Descripción general de la estructura del complejo central de liasa CP con un dímero de PhnK E171Q en la conformación unida a ATP con el dímero PhnK en rojo y el complejo central de liasa CP en gris, excepto el dominio de inserción central PhnJ (CID) , responsable de la unión de PhnK, que se muestra en azul. c Descripción general de la estructura del dímero PhnK ABC unido a PhnL en la conformación abierta con el dímero PhnL en amarillo y PhnK en gris excepto la región C-terminal, responsable de la interacción, que se muestra en rojo. d Detalles del sitio de unión ATP del transportador ABC Sav1866 de S. aureus (unido a ADP). e Detalles del sitio de unión PhnK ATP (unido a AMPPNP). f Detalles de ATP unido al sitio activo de PhnL.

Dado que el complejo central de liasa C-P ha aparecido monolítico en todas las estructuras anteriores, creemos que el reordenamiento estructural de una conformación cerrada a una abierta es significativo y proporcionará nuevas formas de comprender el complejo proceso catalítico de la descomposición del fosfonato por esta vía. Presumiblemente, la naturaleza inaccesible del sitio de unión del metal entre PhnI y PhnJ evita la disociación del ligando en el estado cerrado. Por el contrario, esto también sugiere que la apertura del complejo y la ocupación completa del ion Zn2+ podría inducir el intercambio de sustrato. Y, por extensión, la unión del sustrato podría ser un requisito para el cierre del complejo central, lo que explicaría por qué siempre hay densidad para un ligando cerca del Zn2+ en el estado cerrado14. Juntos, los resultados presentados aquí nos permiten proponer un modelo para los reordenamientos estructurales que tienen lugar en C-P liasa durante una parte del ciclo de reacción (Fig. 6). Inicialmente, el complejo central estaría en un estado cerrado con sustrato unido, PhnK en el estado ATP y PhnL en un estado semiabierto (Fig. 6, arriba a la izquierda). Esto podría desencadenar una reacción en el sitio activo de la enzima, así como la hidrólisis de ATP en PhnK. Luego, las dos subunidades de PhnK se separarían, abrirían el complejo central y permitirían el cierre de PhnL. En este estado, el sitio activo está abierto y podría tener lugar un intercambio de sustrato/producto (Fig. 6, abajo a la derecha). La unión de otro sustrato al sitio podría desencadenar el cierre renovado del núcleo y la hidrólisis de ATP en PhnL, seguido de la apertura del dímero de PhnL.

Un modelo esquemático que representa un posible ciclo funcional para C-P liasa con estados conocidos (observados) en colores y estados putativos en gris. En la parte superior izquierda, el complejo central de liasa C-P (PhnGHIJ, azul) se une a dos dímeros de PhnK (rojo, en el estado unido a ATP) y PhnL (parcialmente abierto), así como al sustrato. Este complejo puede unir ATP en PhnL antes de posiblemente desencadenar una reacción en el complejo central y la hidrólisis de ATP y la liberación de Pi en el dímero PhnK. La hidrólisis de PhnK ATP provoca la apertura del núcleo para permitir la liberación del producto mientras que las subunidades PhnL pueden formar un dímero cerrado y se intercambia el sustrato. Después de la unión renovada del sustrato, el núcleo se cierra mientras acerca las dos subunidades PhnK en un estado unido a ATP. Finalmente, PhnL hidroliza ATP, libera ADP + Pi y se separa, volviendo a la posición inicial.

En esta etapa, sin embargo, no está claro exactamente durante qué parte de la vía de transformación química tienen lugar estos reordenamientos, pero alguna evidencia sugiere que podría ser el primer paso, que se ha demostrado que involucra tanto PhnG, PhnH, PhnI y PhnL y ATP (Fig. 1 complementaria). El mecanismo de reacción de la maquinaria C-P liasa bacteriana sigue siendo un enigma sin resolver en biología desde su descubrimiento hace más de 35 años2,13. La complejidad química de la vía, la multitud de dominios de proteínas y enzimas que interactúan, sus dependencias internas y el requisito de condiciones de reacción anaeróbicas ha demostrado ser una combinación desafiante. Sin embargo, se ha logrado un progreso constante en los últimos años, tanto desde el punto de vista bioquímico como estructural, y ahora estamos comenzando a revelar lentamente algunos de los secretos internos de este fascinante sistema molecular8,14,15. Para seguir adelante, creemos que será importante estudiar la enzima en condiciones anaeróbicas usando condiciones de expresión suaves que permitan la incorporación natural del grupo Fe4S4. Además, es posible que la función de la CP liasa esté relacionada con su localización intracelular. Por lo tanto, para obtener una imagen completa, debemos acercarnos lo más posible al estado natural y estudiar la reacción que tiene lugar dentro de las células.

El plásmido pHO575 que codifica PhnGHJIK con una etiqueta His C-terminal en PhnK se introdujo en la cepa de E. coli HO2735 (Δ(lac)X74 ΔphnCDEFGHIJKLMNOP 33–30/F lacIq zzf::Tn10)14. Las células se cultivaron en medio Luria Bertani (LB) que contenía 100 μg/mL de ampicilina en una incubadora con agitación a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600 de 0,5, momento en el que se indujo la expresión génica usando isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 0,5 mM. (IPTG). La expresión se llevó a cabo durante la noche a 20 °C, después de lo cual las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en HEPES 50 mM/NaOH pH 7,5, NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, MgCl2 5 mM, β-mercaptoetanol (BME) 3 mM, Glicerol al 20 % (v/v) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, lisado por sonicación y centrifugado a 23 400 × g durante 45 min a 4 °C. El sobrenadante se cargó en una columna HP His-Trap preequilibrada de 5 ml (Cytiva), se lavó con HEPES 50 mM/NaOH pH 7,5, NaCl 650 mM, imidazol 20 mM, MgCl2 5 mM, BME 3 mM y ( v/v) glicerol seguido de HEPES/NaOH 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, MgCl2 5 mM, BME 3 mM, glicerol al 20 % (v/v) e imidazol 50 mM antes de la elución en el mismo tampón con imidazol 300 mM. Las muestras purificadas se cargaron en un Source 15Q (Cytiva) de 1 ml preequilibrado con HEPES/NaOH 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM y BME 5 mM, se lavaron y eluyeron usando un gradiente lineal de 100 a 800 mM. NaCl sobre 20 volúmenes de columna (CV). Las muestras que contenían PhnGHIJK se diluyeron a ~100 mM NaCl antes de cargarlas en una columna MonoQ, preequilibrada en 50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 y 5 mM BME, antes de la elución usando un gradiente de 100 a NaCl 500 mM sobre 36 CV. Los picos individuales se agruparon y concentraron utilizando filtros de ultrafiltración Vivaspin 20 antes de cargarlos en una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 Increment 10/300 GL preequilibrada en HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 125 mM y BME 5 mM. Finalmente, las fracciones de los picos se almacenaron en hielo hasta que se usaron para las rejillas crio-EM.

Las rejillas Cryo-EM (C-Flat 1.2/1.3 rejillas de cobre de malla 400, Protochips) se sometieron a descarga luminiscente durante 90 s a 10 mA utilizando un sistema GloQube (Quorum Technologies) inmediatamente antes de aplicar 3 μL de Phn(GHIJ)2K purificado (1,7 mg/mL), transferencia (6–7 s) y congelación por inmersión en etano líquido usando un congelador de inmersión Leica EM GP2 ajustado a 5 °C, 100 % de humedad y una temperatura de etano de −184 °C. Los datos EM se recopilaron en el Electron Bio-Imaging Center (eBIC) en Diamond Light Source, Reino Unido, en un Titan Krios 300 keV con un detector de electrones directo (Gatan K3), un filtro de energía operado con un ancho de rendija de 20 eV utilizando SerialEM25 para adquisición de datos. Se recogieron 17.088 películas con una exposición de 0,2 s por fotograma en 40 fotogramas con una dosis de 1,3 e−/Å2/fotograma correspondiente a una exposición total de 52 e−/Å2, con un desenfoque que oscila entre −0,7 y −2,0 μm nominal el aumento se fijó en 135.000 dando un tamaño de píxel físico de 0,83 Å en el modo de conteo. La calidad de la recopilación de datos se supervisó ejecutando RELION-326 en modo de transmisión a través de relion_it.py.

La corrección de movimiento basada en cuadros se realizó utilizando la implementación de RELION de MotionCor227, mientras que la estimación de CTF se realizó utilizando Gctf28 dentro de RELION-3. Los subconjuntos de las micrografías se utilizaron para la selección de Laplacian de Gauss en RELION-3 antes de la extracción con 8,75 intervalos de tiempo y clasificación 2D. Las buenas clases 2D se usaron como plantillas para la selección basada en plantillas, después de lo cual estas partículas se extrajeron utilizando 6 intervalos y se llevó a cabo la clasificación 2D para eliminar las partículas malas. A continuación, las partículas se extrajeron de nuevo mediante un binning de 4 veces, seguido de la generación del modelo inicial y la clasificación en 3D. Las clases 3D resultantes que se asemejan a PhnGHIJK comprendían una pila de 1.329.400 partículas. Una segunda ronda de clasificación 3D en RELION-3 y refinamiento heterogéneo en cryoSPARC (Structura Biotechnology Inc.)29 condujo a una pila final de 901 800 partículas. Luego, estas partículas se trasladaron nuevamente a RELION-3.1, donde se refinaron aún más mediante el pulido bayesiano, el refinamiento CTF por partícula, la estimación de aberraciones de orden superior, la inclinación del haz y la ampliación anisotrópica30. Después del auto-refinamiento en RELION-3.1, se alcanzó una resolución FSC con enmascaramiento de 2,18 Å. El mapa resultante mostró gran detalle del complejo central (PhnGHIJ), que concordaba bien con la estructura determinada previamente por cristalografía de rayos X14, mientras que la subunidad PhnK mostraba una resolución local significativamente más baja. Para mejorar la estructura de PhnK, se utilizó la clasificación 3D con resta de señal y variabilidad 3D18,19, como se detalla en la Fig. 3 complementaria. Las partículas de las clases resultantes que mostraban una densidad interpretable para PhnK se volvieron a extraer y usar para nuevas ejecuciones de refinamiento automático 3D. El mapa resultante tenía una resolución FSC de 2,57 Å y una resolución local mejorada para PhnK. Se construyó un modelo inicial usando la estructura publicada de Phn(GHIJ)2 (4XB6)14 y un modelo predicho de PhnK de Phyre231 para el modelado de cuerpo rígido usando UCSF Chimera32. Este modelo se ajustó aún más al mapa usando Namdinator33 y se construyó manualmente en Coot34 para las regiones del mapa con mayor resolución, mientras que ISOLDE35 se usó para las regiones de menor resolución e interpretabilidad. El modelo final se refinó y validó utilizando el refinamiento del espacio real de Phenix36,37.

pRBS01 para la expresión de Phn (GHIJKL) 2 se construyó utilizando el ensamblaje Gibson38 mediante la amplificación de phnGHIJKLMNOP de pBW12039 y la inserción de una secuencia que codifica una etiqueta TEV-2xStrep en el extremo 3 'de phnK (consulte las Tablas complementarias 2 y 3 para plásmidos y cebadores utilizado en este trabajo). El pET28a linealizado se preparó mediante PCR usando los cebadores RBS01 y RBS02, mientras que el sitio TEV-2x-Strep se preparó a partir de una secuencia gBlock usando los cebadores RBS03 y RBS04. Los dos fragmentos que contenían los genes phn se prepararon a partir de pBW120 utilizando los cebadores RBS05 + RBS06 (phnGHIJK) y RBS07 + RBS08 (phnLMNOP), respectivamente. El plásmido linealizado se mezcló con un exceso de 2 a 3 veces de los tres fragmentos del inserto, seguido de la adición de Gibson Assembly® Master Mix (New England Biolabs) y la incubación a 50 °C durante 60 min. Los plásmidos ensamblados se transformaron en células competentes NEB 10-β de la cepa E. coli (New England Biolabs) y se sembraron en agar LB que contenía 50 μg/mL de kanamicina. Los mutantes de PhnK/PhnL se construyeron mediante PCR utilizando pRBS01 como molde y conjuntos de cebadores SKA01 + SKA02 (PhnK E171Q) y SCO01 + SCO02 (PhnL E175Q). El mutante doble se construyó utilizando estos dos conjuntos de cebadores en reacciones de mutagénesis PCR secuenciales.

Para el análisis crio-EM, se transformó pRBS01-PhnK E171Q en células E. coli Lemo21 competentes (New England Biolabs). Las células se cultivaron en medio LB que contenía L-ramnosa 300 μM, cloranfenicol 34 μg/mL y kanamicina 50 μg/mL hasta una DO600 de ~0,5 antes de la adición de IPTG 1 mM. Las células se incubaron a 37 °C durante 3-4 h antes de la recolección. Las células recolectadas se resuspendieron en tampón de lisis que contenía HEPES/KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 125 mM, MgCl2 5 mM, glicerol al 10 %, BME 5 mM, DNasa I 1 μg/mL, PMSF 1 mM y adenosina-5' 5 μM. -[(β-γ)-imido]trifosfato (AMPPNP) y lisado por sonicación. El lisado se aclaró mediante centrifugación a 23 400 × g durante 45 min a 4 °C y se cargó en una columna StrepTrap HP de 1 ml (Cytiva) que se mantuvo a 8 °C y se había equilibrado previamente en tampón de lisis. La columna se lavó con 10 CV de un tampón de lavado StrepTrap (HEPES/KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 125 mM, MgCl2 5 mM, BME 5 mM y AMPPNP 5 mM) antes de la elución con 5 CV de este tampón, incluidos D 2,5 mM. -destiobiotina. Las fracciones relevantes se analizaron mediante SDS-PAGE y se almacenaron en hielo.

Las rejillas UltrAuFoil 0.6/1 se descargaron luminiscentemente (10 mA, 90 s, GloQube, Quorum) inmediatamente antes de dispensar 3 μL de proteína recién purificada diluida en tampón de lavado StrepTrap a una concentración de 2,5 mg/mL seguido de transferencia (7–9 s) y congelación por inmersión inmediata en etano líquido usando un congelador de inmersión Leica EM GP2, ajustado a 5 °C, 100 % de humedad y una temperatura de etano de −184 °C. Los datos de Cryo-EM se adquirieron en la Instalación Nacional Danesa de Cryo-EM (EMBION) – nodo AU (iNANO, Universidad de Aarhus) en un Titan Krios G3i (Thermo Fisher Scientific) operado a 300 keV usando un detector de electrones directos K3 (Gatan), un filtro de energía Bioquantum (Gatan) con un ancho de rendija de 20 eV y EPU (Thermo Fisher Scientific) para la recolección de datos automatizada. Los datos se recopilaron en el modo de superresolución contado con un aumento nominal de 130 000 con corrección de ganancia sobre la marcha seguida de binning de 2× en EPU, lo que resultó en una salida de películas con un tamaño de píxel físico (0,647 Å/píxel). Se determinó la altura eucéntrica para cada cuadrado de la cuadrícula y se adquirieron los datos utilizando un rango de desenfoque de -0,5 a -1,4 μm y una fluencia de electrones de 62 e-/Å2 en 56 fotogramas. La calidad de los datos se controló y procesó inicialmente a través de cryoSPARC Live.

Todos los datos se procesaron dentro de cryoSPARC. Inicialmente, se corrigió el movimiento de parches de las micrografías, seguido de una estimación y filtrado de CTF de parches utilizando varios indicadores de calidad de datos. Las partículas se seleccionaron inicialmente con un selector de manchas gaussianas, después de lo cual se extrajeron partículas divididas en 4x y se sometieron a clasificación 2D. Se mantuvieron las partículas de buenas clases 2D y se inició un trabajo de recolección manual usando un subconjunto de 14 micrografías donde se recolectaron más partículas. El conjunto recopilado de partículas seleccionadas se utilizó para entrenar el selector profundo, después de lo cual el modelo se utilizó para seleccionar partículas las 4502 micrografías restantes.

La estrategia de procesamiento de datos se muestra en la Fig. 4 complementaria. En resumen, se extrajo un total de 1 530 855 partículas mediante el uso de intervalos de 4 × y se sometieron a clasificación 2D, luego de la selección de buenas clases 2D y la reconstrucción 3D ab initio utilizando cinco clases y refinamiento heterogéneo utilizando el mismas clases. Una clase que mostraba la estructura Phn(GHIJKL)2 se sometió a un refinamiento homogéneo y las partículas alineadas se usaron para el análisis de variabilidad 3D19. Para el análisis de variabilidad 3D, se determinaron tres modos principales ortogonales con una resolución filtrada a 5,5 Å, las partículas de diferentes conformaciones se separaron agrupando las partículas utilizando sus modos principales en cuatro grupos diferentes. Se seleccionó un grupo y las partículas de esta clase se usaron para la corrección del movimiento local después de la extracción en una caja de 420×420 píxeles agrupada en 1,48× y se usaron para el refinamiento con simetría C2 impuesta, lo que dio una resolución FSC final de 2,09 Å para 59 737 partículas. Este mapa se procesó aún más mediante la determinación de la resolución local y durante el filtrado y la nitidez locales utilizando los datos de resolución local. Para la construcción del modelo, el complejo central PhnGHIJ y PhnK de la estructura Phn(GHIJ)2K se acoplaron individualmente al mapa usando ChimeraX40 mientras se generaba un modelo PhnL usando Phyre231. El modelo se mejoró aún más mediante el ajuste del mapa con Namdinator33, luego de la corrección de las cadenas individuales y la adición de ligandos e iones con ISOLDE35. El modelo se inspeccionó en Coot34, donde se agregaron residuos adicionales cuando estaban visibles en el mapa. El modelo final se refinó y validó utilizando el refinamiento del espacio real de Phenix36.

La expresión y purificación de Phn(GHIJKL)2 con PhnK de tipo salvaje de pRBS01 siguió el mismo protocolo que el mutante PhnK E171Q. Después de la purificación con StrepTrap, la muestra se trató con proteasa TEV (proteasa TEV 1:50 p/p) a 8 °C durante la noche, después de lo cual la muestra se cargó en una columna MonoQ 5/50 (Cytiva), preequilibrada en 25 mM. HEPES/KOH, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, glicerol al 10 %, BME 5 mM y AMPPNP 1 μM). La proteína se eluyó utilizando un gradiente de KCl 200-450 mM durante 36 CV, después de lo cual se agruparon los picos individuales. La muestra de Phn(GHIJKL)2 se concentró utilizando un filtro Vivaspin 20 y se cargó en una columna Superdex 200 de aumento 10/300 (Cytiva) equilibrada en HEPES/KOH 25 mM, KCl 125 mM, EDTA 0,5 mM, BME 5 mM y BME 0,25 mM. ATP. La proteína purificada se concentró y almacenó a 4 °C.

Una muestra de Phn(GHIJKL)2 purificado (2,5 mg/mL) se mantuvo en hielo y se incubó con ATP a una concentración de 1,5 mM seguido de la adición de MgCl2 a una concentración de 6 mM para activar la reacción de ATPasa, luego se incubó durante 15 s a 37 °C e inmediatamente congelados por inmersión en rejillas de descarga luminiscente (10 mA, 90 s, GloQube, Quorum) UltrAuFoil 0.6/1 utilizando un congelador de inmersión Leica EM GP2 ajustado a 37 °C, 100 % de humedad y una temperatura de etano de −184 °C y un tiempo de transferencia de 6–9 s. Los datos se adquirieron de forma similar a Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q y se procesaron dentro de cryoSPARC. Las micrografías se corrigieron con el movimiento del parche, luego se calculó el CTF del parche y se filtraron utilizando varios indicadores de calidad de datos. Las partículas se seleccionaron inicialmente con un selector de manchas gaussianas, después de lo cual se extrajeron partículas divididas en 4x y se sometieron a clasificación 2D. Se mantuvieron las partículas de clases 2D claras y se inició un trabajo de recolección manual usando un subconjunto de 14 micrografías donde se recolectaron más partículas. El conjunto recolectado de partículas seleccionadas se utilizó para entrenar el selector profundo, después de lo cual el modelo se utilizó para seleccionar partículas las 3741 micrografías restantes.

El procesamiento inicial de datos se realizó como para el conjunto de datos Phn(GHIJKL)2-Phn E171Q, utilizando 1 155 385 partículas de 3741 micrografías. La estrategia de procesamiento de datos se muestra en las figuras complementarias. 8 y 9. Las partículas seleccionadas se extrajeron usando binning de 2,75x y se sometieron a clasificación 2D, luego de la selección de buenas clases 2D. Las partículas seleccionadas de la clasificación 2D se usaron luego para la reconstrucción 3D ab initio usando cuatro clases, y las partículas de las clases que mostraban características similares a las proteínas se usaron luego para el refinamiento no uniforme41. Las partículas resultantes del refinamiento no uniforme se sometieron a análisis de variabilidad 3D19 para separar diferentes conformaciones entre sí utilizando tres modos principales ortogonales que se determinaron con resolución filtrada a 6 Å, después de lo cual las partículas de diferentes conformaciones se separaron en 8 grupos diferentes mediante agrupamiento según los modos principales obtenidos. Para la estructura Phn(GHIJKL)2 WT, se seleccionaron dos grupos y las partículas correspondientes se sometieron a corrección de movimiento local por partícula y se volvieron a extraer en un cuadro de 480 × 480 píxeles agrupado en 1,29 ×. El conjunto final de 222 056 partículas se usó luego para un refinamiento no uniforme usando simetría C2 para obtener el mapa final con una resolución FSC de 1,93 Å (Fig. 9a complementaria). Para la conformación cerrada de Phn (GHIJK) 2, se seleccionó un grupo y las partículas se volvieron a extraer en un cuadro de píxeles de 386 × 386 agrupados en 1,42 ×. El conjunto final de 81 605 partículas se usó para un refinamiento no uniforme con simetría C2, lo que dio un mapa con una resolución FSC de 1,98 Å (Fig. 9b complementaria). Para la conformación abierta de Phn(GHIJK)2, cuatro grupos de la primera ronda de análisis de variabilidad 3D se sometieron a otra ronda de análisis de variabilidad 3D y agrupación. Se seleccionó un grupo y las partículas se volvieron a extraer en una caja de píxeles de 386 × 386 agrupada en 1,42 ×. El conjunto final de 31 280 partículas se usó para un refinamiento no uniforme y dio un mapa con una resolución FSC de 2,57 Å (Fig. 9c complementaria). Este mapa se procesó aún más mediante la determinación de la resolución local y durante el filtrado local y la nitidez del mapa utilizando los datos de resolución local.

Para la construcción del modelo de Phn(GHIJKL)2 WT, el modelo final de Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q se acopló inicialmente al mapa. Se intercambiaron ligandos, se agregaron aguas usando Phenix Douse36 y el modelo se construyó manualmente usando Coot e ISOLDE. El modelo final se refinó y validó utilizando el refinamiento del espacio real de Phenix. En el sitio de unión de Zn2+ en PhnI, las longitudes de enlace del ligando se restringieron utilizando datos de C. Lim y T. Dudev, 200042. Para la conformación abierta de Phn(GHIJK)2, el modelo inicial se basó en la estructura Phn(GHIJKL)2 de tipo salvaje , que se dividió en dos partes, una que contenía PhnG2HI2JK y otra que contenía PhnHJK, cada una de las cuales representaba un lado del complejo de núcleo abierto, y las dos se acoplaron individualmente en el mapa mediante ChimeraX. El modelo se reconstruyó utilizando ISOLDE y Coot, excepto las dos moléculas de PhnK y parte de una de las moléculas de PhnJ, que no se modificaron debido a la baja resolución local. El modelo final se refinó y validó utilizando el refinamiento del espacio real de Phenix, sin el refinamiento de las cadenas de PhnK. Para la conformación cerrada Phn(GHIJK)2, la estructura Phn(GHIJKL)2 sin PhnL se acopló primero al mapa, se intercambiaron ligandos y se eliminaron las aguas. El modelo final se refinó utilizando el refinamiento del espacio real de Phenix.

Para la complementación, se construyó un plásmido (pSKA03) que contenía el operón phn completo, incluida la caja pho, basándose en pBW120 mediante la eliminación de secuencias no esenciales. Inicialmente, se crearon dos fragmentos grandes mediante PCR, un esqueleto de plásmido con los cebadores SKA03 y SKA04 y otro que contenía el operón phn, incluida la caja pho, con los cebadores SKA05 y SKA06. Los productos se trataron con la endonucleasa de restricción DpnI y se transformaron juntos (300 ng cada uno) en células E. coli NovaBlue competentes para lograr una clonación independiente de RecA43. El ADN del plásmido se purificó a partir de clones positivos y se confirmó mediante secuenciación de nucleótidos. Posteriormente, las mutaciones puntuales PhnJ E149A, PhnJ Y158A, PhnK R78A/R82A, PhnK E171Q y PhnL E175Q se introdujeron mediante PCR utilizando los cebadores SKA07 y SKA08 para PhnJ E149A, SKA09 y SKA10 para PhnJ Y158A, SKA11 y SKA12 para PhnK R78A/R8. 2A , SKA13 y SKA14 para PhnK E171Q y SKA15 y SKA16 para PhnL E175Q. Para la complementación, se usó la cepa HO1488 de E. coli knock-out para fosfonatos (ΔphnHIJKLMNOP). La cepa HO1488 se cultivó en LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina hasta una DO600 de ~0,3, se concentró por centrifugación y se resuspendió en 200 μL de TSB enfriado con hielo (10 % p/v de PEG 3350, 5 % de DMSO y 20 mM de MgCl2 en LB medio) para hacer que las células sean competentes para la transformación del ADN por choque térmico con el ADN de los plásmidos mencionados anteriormente. Las células transformadas se cultivaron en placas de agar mínimo MOPS44 que contenían glucosa al 0,2 %, 100 μg/ml de ampicilina, 34 μg/ml de kanamicina y 0,2 mM de K2HPO4, 2-aminoetil fosfonato, metil fosfonato o ninguna fuente de fosfato añadido.

Se incubaron complejos Phn(GHIJKL)2 purificados con etiqueta de estreptococo (tipo salvaje, PhnK E171Q, PhnL E175Q y PhnK E171Q + PhnL E175Q) a una concentración de ~200 nM con ATP 5 mM en HEPES/KOH 50 mM pH 7,5, 300 mM KCl, MgCl2 10 mM y BME 5 mM a 30 °C durante la noche. Se cargaron 100 μL de una dilución 1:20 de la mezcla de reacción en una columna MonoQ (Cytiva) preequilibrada en HEPES/KOH 25 mM pH 7,5, MgCl2 5 mM y BME 5 mM y se eluyó usando un gradiente de 0 a 180 KCl mM sobre 7 CV. La columna se calibró con muestras conocidas de ATP, ADP, AMP y adenina para permitir la identificación de posibles productos de reacción. La tasa cuantitativa de hidrólisis de ATPasa se midió mediante un ensayo enzimático acoplado realizado a 37 °C en HEPES/KOH 25 mM, KCl 125 mM, EDTA 0,5 mM, BME 5 mM y ATP 0,25 mM con la adición de fosfoenolpiruvato 1 mM, 350 NADH μM, piruvato quinasa 0,04 mg/ml, lactato deshidrogenasa 0,1 mg/ml, MgCl2 10 mM y ATP hasta una concentración final de 1 o 5 mM. La reacción se inició mediante la adición de 0,02 mg de tipo salvaje purificado con StrepTrap, PhnK E171Q, PhnL E171Q o mutante doble PhnK E171Q/PhnL E175Q en un volumen total de 0,35 ml, lo que dio como resultado una concentración de proteína final de 0,057 mg/ml. La conversión de ATP a ADP se calculó a partir de las tasas de oxidación de NADH medidas utilizando un coeficiente de extinción de 6,2 L mM-1 cm-1 a 340 nm. La reacción se siguió durante 6 min y la velocidad de reacción se midió usando un ajuste lineal a la degradación de NADH a NAD+.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos estructurales generados en este estudio se han depositado en Protein Data Bank y EM Data Bank con los códigos de acceso 7Z19 y EMDB-14445 (Phn(GHIJ)2K), 7Z16 y EMDB-14442 (Phn(GHIJKL)2 PhnK-E171Q: AMPPNP), 7Z15 y EMDB-14441 (Phn(GHIJKL)2 WT:ADP + Pi), 7Z18 y EMDB-14444 (Phn(GHIJK)2 WT:ATP cerrado), y 7Z17 y EMDB-14443 (Phn(GHIJK)2 WT: ATP abierto). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Este trabajo fue posible gracias al acceso al Centro Holandés de Nanoscopia Electrónica (NeCEN) en la Universidad de Leiden, un centro Instruct-ERIC, con la asistencia de Ludo Renault, el Centro de Bioimagen Electrónica (eBIC) en Diamond Light Source, Reino Unido, y el nodo Aarhus de Danish National Cryo-EM Facility (EMBION) (iNANO, Universidad de Aarhus, Dinamarca). Los autores también agradecen al Clúster de computación de microscopía electrónica de la Universidad de Aarhus (EMCC), a Thibaud Louis Antoine Dieudonné por su ayuda con el ensayo de ATPasa, y a Mogens Johannsen y Camilla Bak Nielsen por su ayuda con el análisis diferencial UPLC-QTOF-MS de metabolitos fosforilados unidos. El apoyo financiero fue proporcionado por Instruct-ERIC (PID 1514) y una subvención de la Fundación Novo Nordisk (subvención no. NNF18OC0030646) a DEB

Soren K. Amstrup y Nicholas Sofos

Dirección actual: Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, Universidad de Copenhague, Blegdamsvej 3B, DK-2200, Copenhague N, Dinamarca

Departamento de Biología Molecular y Genética, Universidad de Aarhus, Universitetsbyen 81, DK-8000, Aarhus C, Dinamarca

Søren K. Amstrup, Sui Ching Ong, Nicholas Sofos, Jesper L. Karlsen, Ragnhild B. Skjerning, Jan J. Enghild, Bjarne Hove-Jensen y Ditlev E. Brodersen

Centro Interdisciplinario de Nanociencia (iNANO) Universidad de Aarhus, Gustav Wieds Vej 14, DK-8000, Aarhus C, Dinamarca

Tomas Boesen

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SKA, SCO, NS, BHJ y DEB diseñaron y SKA, SCO, NS, JJE y RBS llevaron a cabo los experimentos; NS, SKA y TB recopilaron datos de EM; NS determinó la estructura EM inicial de Phn(GHIJ)2K a una resolución más baja con la ayuda de JLK, mientras que SKA determinó todas las estructuras de alta resolución y llevó a cabo el refinamiento y la validación de la estructura; SKA y DEB escribieron el borrador del manuscrito y produjeron figuras, y todos los autores revisaron el texto.

Correspondencia a Ditlev E. Brodersen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Andrew Hitchcock y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Amstrup, SK, Ong, SC, Sofos, N. et al. Remodelación estructural de la maquinaria de liasa de carbono-fósforo por una ABC ATPasa dual. Nat Comun 14, 1001 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36604-y

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Recibido: 03 Mayo 2022

Aceptado: 08 febrero 2023

Publicado: 22 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36604-y

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